克隆的筛选和快速鉴定

实验概要

掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。

实验原理

在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂---SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。
  或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。  

主要试剂

1、破碎细胞缓冲液 50mmol/L Tris-HCl (pH6.8) 1% SDS 2mmol/L EDTA 400mmol/L蔗糖 0.01%溴酚蓝 配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8)         10毫升           20%    SDS                  10毫升           250mmol/L EDTA              1.6毫升            蔗糖                         27.2克            1.2%溴酚蓝                  1.67毫升            加ddH2O至200毫升
  2、10mg/ml 溴乙啶 3、TBE电泳缓冲液（5×） 4、Taq DNA聚合酶 5、10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2） 6、dNTP 7、点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。  

主要设备

1、电泳仪 2、1.5ml 离心管 3、Tip  4、培养皿 5、PCR扩增仪 7、台式离心机 8、紫外分析仪 9、恒温水浴  

实验步骤

一、快速细胞破碎法测定 1、取1.5ml离心管编号码，每管加入50ul破碎细胞缓冲液。 2、取一培养皿在底部标记如图所示 3、待转化的细菌菌落长到2mm时 4、用牙签挑取单克隆将菌落点在作好标记的方格内，然后将牙签加入对应的培养管中（培养管中含5ml LB液体培养基）。 5、培养皿37℃×6 h后4℃保存。培养管37℃×12 h左右。 6、用培养管中的菌液提取质粒。 7、酶切电泳检查质粒。
  二、菌落PCR快速鉴定法 1、直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入25ul或50ul PCR反应体系中。 2、用通用引物或特异引物进行PCR，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向（反应体系参照前面实验）。