免疫学测定技术的应用与研究进展

现代免疫学测定技术源于标记技术的发展。继1941年Coons等创立荧光素标记抗体技术(f1uorescent antibody technique)以来，上个世纪50年代末60年代初,Yalow等创立了放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)技术，1966年由美国和法国学者又同时报道建立了酶免疫测定技术(enzyme immunoassay,EIA),包括:酶免疫组化技术,固相酶免疫测定(如ELISA,western blotting)和均相酶免疫测定(又称酶放大免疫分析技术,EMIT)。另一传统标记技术为胶体金标记免疫分析始于上个世纪80年代，除应用于免疫电镜外，广泛用于免疫渗滤和免疫层析试验[1]。除此之外,目前又相继报道建立了一些新型标记免疫测定技术,如元素标记免疫测定，核酸标记免疫测定和量子点标记免疫测定技术。这些技术及由此衍生的实验方法有些已在临床免疫学检验中得到了广泛的应用，有些尚处于研究和探索阶段。本文主要就相关技术的应用及进展综述如下。
1．荧光素标记的免疫测定技术
1．1 间接免疫荧光技术(IFA) 长期以来用作细胞内抗原定位或相应抗体检测的“金标准”,适合用作筛查实验,主要用于抗核抗体(ANA)、抗ds-DNA抗体、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)等自身抗体,及某些病原体如EB病毒、SARS病毒、军团菌及其他呼吸道病原体抗体的检测等[2,3]。目前已有商品化的全自动操作系统,可以自动完成对样品的稀释、加样、温育、洗涤等过程。最后借助于激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观察结果。其技术特点是减少手工操作可能造成的偶然误差，提高了免疫试验的标准化和自动化程度，缩短了实验所需的时间。
1．2 流式细胞免疫荧光分析(FCM) 该技术借鉴了荧光抗体与血细胞分析仪原理, 经历了从相对细胞计数到绝对细胞计数, 从细胞膜成份到细胞内成份, 从单色荧光到多色荧光的发展历程, 并将分子表型与免疫表型分析相结合, 因而成为细胞分析和分选的重要工具[4]。其工作流程包括标本处理与荧光染色, 激光聚焦检测, 流动控制, 信号的处理与放大, 以及计算机分析和结果打印。在细胞表型 (celluar phenotype)分析、DNA含量与细胞周期分析、细胞内及核膜成分分析及细胞分选等领域有着广泛的应用。
1．3 以荧光标记为基础的四聚体分析技术 该技术主要是基于MHC/抗原肽复合物与T细胞表面受体(TCR)相互作用的原理而设计的。首先选择某一抗原特异性Ｔ细胞所识别的抗原表位肽以及与该表位肽结合的HLA分子，使之形成HLA-肽复合物，进一步生物素化后再与特定荧光素(如PE)标记的链霉亲合素按照一定比例混合，如此构建的四聚体即可通过其本身MHC分子提呈的表位肽与Ｔ细胞表面的TCR进行精确识别和高亲和力结合而达到检测抗原特异性T细胞的目的[5]。由其衍生的主要技术类型包括:(1)MHC-肽四聚体流式细胞术，特点是快速、敏感、特异，可计数所有抗原特异性Ｔ细胞,不管这些细胞是原始的或效应的,有功能的或无功能的;(2)原位MHC-肽四聚体染色法(IST)，又可分为直接法和间接法两种，用于组织切片染色，检测抗原特异性T细胞在空间和时间上的分布;(3) MHC-肽四聚体磁分离技术，分离的抗原特异性T细胞可用于进一步分析其生物学功能;(4)MHC-肽四聚体ELISA法;(5)MHC-肽四聚体分子微阵列技术。上述以荧光标记为基础的四聚体分析技术均已应用于病毒(如HBV、HCV和HIV等)抗原、肿瘤抗原特异性Ｔ细胞和自身免疫病相关的自身反应性T细胞(ART)的测定和研究中。