免疫碱性磷酸酶组织化学实验——APAAP法

APAAP 法的原理与 PAP 法类似，都属于未标记抗体桥联法，所不同的是用 AKP 取代了 HRP。该方法较 IAP 法敏感性髙，特别是用于标记固定过的组织。APAAP 法的主要优点是非特异性背景染色较浅，因为其不受内源性过氧化物酶的干扰，APAAP 复合物所用的 AKP 是从小牛肠组织中提取，只存在于肠组织。同时，反应底物溶液中的左旋咪唑具有抑制非肠源性碱性磷酸酶活性的作用，且不影响 APAAP 复合物中肠源性 AKP 的活性。因此，在检测那些富含内源性过氧化物酶的组织、冰冻切片及造血组织标本时，APAAP 法是一种很好的方法。

石蜡切片动物血清

蛋白酶特异性一抗桥抗体核固红二甲苯乙醇树胶PBS

滴管玻片

1. 切片脱蜡至水，PBS 洗 3 min × 3 次。

2. 蛋白酶消化或 AR（组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定）。

3. 滴加正常血清，阻断 20 min（减少非特异性背录染色），吸去多余血清。

4. 滴加适当稀释的特异性一抗，37℃ 孵育 30～60 min 或 4℃ 过夜，PBS 洗 3 min × 3 次。

5. 适当稀释桥抗体（二抗），37℃ 温育 30 min 或室温中孵育 60 min。

6. PBS 洗 3 min × 3 次。

7. 适当稀释 APAAP 复合物（与特异性一抗同属），37℃ 温育 30 min 或室温中孵育 60 min。8. PBS 洗 3 min × 3 次。

9. 底物显色及复染、封片同 IAP 法。

特异性一抗和 APAAP 复合物中 IgG 必须来源于同一种属动物，第一抗体的稀释度要较 IAP 法高（浓度低）。