免疫组化操作

 （一）、仪器设备
1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
2. 水浴锅

（二）、试 剂
1. PBS缓冲液（pH7.2―7.4）
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）
3. 3%甲醇―H₂O₂溶液：用30%H₂O₂和80%甲醇溶液配制
4. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制
5．TBS/PBS pH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;pH7.0-7.4适合光学纤维标本
（三）、操作流程
1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

                         抗 原 修 复（免疫组化石蜡切片）
        用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复
    福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片现象为佳。
                抗原修复的几种常用方法（供参考）
    1. 微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。
适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本：
    2. 沸热修复： 电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
    3. 高压热修复：在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨及软骨组织的标本选择较温和的微波加热修复）
    4. 酶消化方法：
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：
包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等

               石蜡切片免疫组化染色步骤
                1.三步法（以SP试剂盒为例）
●石蜡切片脱蜡至水。
●蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行。
●3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
●5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
●PBS冲洗，2分钟×3次。
●显色剂显色（DAB或AEC）。
●自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片。
●如果必要，可选用avdin封闭内源性生物素。
                2.SABC法
（1） 脱蜡、水化
（2）PBS洗2次各5分钟
（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次
（4）抗原修复
（5） PBS洗5分钟
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
（7）滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（8）PBS洗3次各2分钟
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟
（10）PBS洗3次各2分钟
（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
（12） PBS洗4次各5分钟
（13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色
（14）脱水、透明、封片、镜检。

冰冻切片的免疫组化染色步骤
●速冻组织
●冰冻切片4~8μm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。
●室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其他的固定方式。
●PBS冲洗，5分钟×3次。
●用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
●PBS冲洗，5分钟×3次。
●下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）