免疫组织化学染色方法

实验概要

免疫组织化学染色法是指在抗体上结合荧光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。

实验原理

免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。

常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescent technique），常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）、罗丹明（rhodamine）等。酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。

抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。

实验步骤

1. 石蜡切片4-5μm；

2. 切片脱蜡至水；

3. 3%甲醇双氧水阻断室温10分钟；

4.  0.01M(PH 7.2)磷酸盐缓冲液洗5分钟3次；抗原修复，加入0.01M（PH 6.0）柠檬酸缓冲液置微波炉中10档3分30秒，之后可进行2档1分至1分30秒微波维持。

5. 自然冷却后洗，加二抗同种动物非免疫血清封闭，室温10分钟；

6. 免洗，倾出血清，分别滴加配制好的一抗4℃过夜；

7. 洗5分钟3次；

8. 滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10分钟；

9. 洗5分钟3次；

10. 滴加链亲和素-过氧化物酶，室温10分钟；

11. 洗5分钟3次；

12. 新鲜配制的DAB溶液显色3-10分钟；

13. 自来水洗，苏木素浅染细胞核，分化。自来水冲洗返兰，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。