免疫组织／细胞化学染色2

四 结果分析

染色结果的判断除了上述之外，还可以从以下方面加以判断：

（1） 阳性反应与非特异性着色区别：阳性反应分布总是有规律性的，局限定位某一部位而非特异性着色则无规律性，无界限，定位不准确，且不能重复，结缔组织受染和内源性产物干扰是最多见的非特异性着色。
（2） 人为造成非特异性反应如切片折叠，刀痕，以及组织处理过程中出现的色素，沉淀物以及组织细胞坏死等都可以出现非特异性反应。
（3） 有的抗原被吞噬细胞吞噬，或停留某一部位，这些都影响抗原的正确定位。
（4） 如阳性对照和待检片都呈阴性反应，检查操作中是否颠倒了抗体顺序或漏加某一抗体；组织在处理中抗原被破坏；某一抗体失效；显色试剂如DAB配制时漏加H2O2等。
（5） 阳性和待测片均呈弱阳性，抗体稀释度过大；切片残留缓冲液过多；孵育时间过短，抗体放置过久效价下降等。
（6） 所有切片过度着色，多见于显色液中H2O2过多，显色过长，切片粘合剂使用不当，切片过厚，抗体稀释不够，或没有用非免疫血清处理切片等。

五 常用液体的配制：
10.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS） PH7.2
NaH2PO4 储备液（A） 19ml
NaHPO4 储备液（B） 81ml
Nacl 17g
加双蒸水至 2000ml
注：A液 0.02M NaH2PO4.2H2O 31.2g 加蒸馏水1000ml
B液 0.02M NaHPO4.2H2O71.6g加蒸馏水1000ml
20.05mol/L TBSPH7.6
0.2mol/LTris 250ml
0.1mol/L Hcl 400ml
Nacl 8.5g
蒸馏水加至 1000ml
2 0.05mol/L枸橼酸缓冲液 PH5.5-6.0
醋酸胺储备液 99.0ml
枸橼酸储备液 1.0ml
注：储备液配制： 醋酸胺1.93g 加蒸馏水500ml
枸橼酸1.05g 加蒸馏水100ml
3 3,3´--二氨基联苯胺（DAB）显色液
DAB 5mg
0.05mol/L PH 7.6 TBS 10ml
30% H2O2 µl5
将5mgDAB溶解于10ml0.05mol/L PH 7.6 TBS中，充分搅拌，使之溶解后，用双层滤纸过滤，用前加 30% H2O2 5µl。显色阳性结果为棕褐色。
4 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）显色液
AEC 4mg
二甲酰胺（DMF） 1ml
0.05mol/L PH5.2 醋酸缓冲液14ml
30% H2O2 µl15
先将AEC溶解于DMF中，再加入醋酸缓冲液，充分 混匀，用前加30% H2O2。显色阳性结果为红色。
5 3%过氧化氢（H2O2）
90ml的蒸馏水或甲醇中加入10ml的30% H2O2 即可。用于封闭内源性过氧化物酶。
6 0.4%胃蛋白酶（Pepsin）
胃蛋白酶400mg溶于100ml的0.1NHCL中即可。消化时间37℃、10-30min。主要用于细胞间质抗原的免疫组化。
7 0.1%胰蛋白酶（Trypsine）
胰蛋白酶 0.1g
0.1%氯化钙100ml
浓Hcl 7ml
首先配制0.1%的CaCl2, 用0.01mol/L的NaOH将其PH值调至7.8，然后加入胰蛋白酶溶解，必要时可过滤。消化时间37℃、5-30min。主要用于细胞内抗原的暴露。