免疫细胞或组织化学染色的相关问题

附上我们这里的组化步鄹：（切片复温凉干完毕）

1。加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MPBS 20ml＋30%过氧化氢 1ml）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；

2。加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100 1ml＋0.01MPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3；

3。加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀释的*抗体4℃反应24-48h。吸去抗体，0.01MPBS洗5min×3；

4。加入血清稀释液或0.01MPBS稀释的二抗，室温孵育2h。吸去二抗，0.01MPBS洗5min×3；

5。加入ABC复合物，室温孵育2h，0.01MPBS洗5min×3，蒸馏水迅速冲三次；

6。加入硫酸镍铵溶液（DAB 25mg＋蒸馏水50ml＋硫酸镍铵醋酸缓冲液50ml＋葡萄糖200mg＋氯化铵40mg＋葡萄糖氧化酶1mg），进行免疫细胞化学显色，时间不超过30min。不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MPBS终止反应；

或直接加入配好的DAB溶液进行显色。

7。梯度酒精（70％、80％、90％酒精5min×1，95％酒精5min×2，100％酒精5min×3）脱水之后，二甲苯透明，中性树脂封片。
而对培养的细胞则比较简单：（细胞种在玻片上）

1。固定液固定10－30min，0.01MPBS清洗2min×3；

2。羊血清封闭液封闭（可以加入0.3% Triton X100 ）30－60min分钟；

3。加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋叠氮纳0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀释的*抗体室温反应1－2h或4℃过夜。吸去抗体，0.01MPBS洗2min×3；

4。加入血清稀释液或0.01MPBS稀释的二抗，室温孵育1h。吸去二抗，0.01MPBS洗2min×3；（如果是荧光二抗就可以直接用50％甘油封片，进行观察了）

5。加入ABC复合物，室温孵育1h，0.01MPBS洗2min×3，蒸馏水迅速冲三次；

6。加入硫酸镍铵溶液（DAB 25mg＋蒸馏水50ml＋硫酸镍铵醋酸缓冲液50ml＋葡萄糖200mg＋氯化铵40mg＋葡萄糖氧化酶1mg），进行免疫细胞化学显色，时间不超过30min。不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MPBS终止反应；

或直接加入配好的DAB溶液进行显色。

7。梯度酒精（70％、80％、90％酒精5min×1，95％酒精5min×2，100％酒精5min×3）脱水之后，50％明胶封片。
1。脱片--
a）切片和贴片一定要过关；
b）冰冻切片从冰箱中拿出必须复温并凉干（室温1－2h）；
c）清洗切片时应放在切片缸内，沿缸壁倒入PBS，静置5－10min，没有晃动的必要。

2。染色背景太深，而且没有阳性显色--
a）灌注要要过关；
b）需用3％双氧水甲醇溶液浸泡切片；
c）需用0.3-0.4%的triton溶液浸泡切片；
d）延长羊血清封闭时间；
e）降低一抗的浓度；（我有一次就是用了较高的一抗浓度，结果没有染出东西，但是降低一抗浓度后，结果非常好，其实这就是抗体的“prozone”--前区现象）