免疫金标记检测方法标准操作程序

【目的】
保证免疫金标技术检验准确性

【本SOP 适用范围】
免疫金标技术

【该SOP 变动程序】
本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【原理】
氯化金分子在还原剂作用下聚合形成金颗粒，颗粒与颗粒之间因静电作用而相互排斥，使其保持一个比较稳定的胶体状态，故称作胶体金。利用胶体金颗粒的高电子密度及其表面能结合生物大分子(如抗体、SPA、植物血凝素和刀豆蛋白A 等)以 及具有一定颜色等特性，可用光镜和电镜对细胞内抗原进行定位、定性的研究。

【方法学分类】
1. 班点金免疫渗滤试验 固相膜免疫测定中液体在微孔膜中穿过流出呈穿流形式，为斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay，DIGFA)，亦有称免疫金溶胶斑点法、滴金免疫测定法等。试验单位为三层反应盒，第一层为过滤器(滤纸层)，第二层为反应膜(NC 膜或MC 膜)上点加有特异性抗原或抗体，第三层为吸水垫料，有称此渗滤装置为滴金反应板。
以双抗体夹心法测dsDNA 为例：试验中将标本加在反应盒上，血清(标本)透过过滤层进入反应层，反应层上点有“一”字形抗IgG(或某种人血清蛋白作为试验阳性对照)及“．”形被测物相应抗体，血清中抗原与反应层中抗体结合，其余无关蛋白等滤出膜片，加入金标记抗体试剂，反应膜上“一”字形及“．”形均显红色为试验阳性，仅“一”形显红色为试验阴性(试剂盒状态良好)，“一”不显色提示试剂盒质量不合格，需另取反应盒重做试验。试剂盒基本试剂成分有滴金反应板、金标记试剂及洗涤液。
2. 斑点金免疫层析试验 固相膜免疫测定中液体通过毛细管作用在膜上向前移行呈横流形式，为斑点金免疫层析试验(dotimmunogoldchromatographyassay，DIGCA)。试验单位为一滤膜条，自上而下分有多个层次。
如单克隆双抗体法测HCG，滤膜条各区域分别为：吸水滤纸—固定有金标二抗的MC 膜—固定有抗β-HCG 抗体的MC 膜—金标记抗。α-HCG 玻璃纤维—吸尿玻璃纤维。试验中将滤膜条浸入被测尿液或滴加尿液，尿液在毛细管作用下向试纸条上端缓缓移行，尿液将金标抗。α-HCG 溶解并带动它向前移动，结合尿中HCG 至抗β-HCG 抗体处形成复合物，并在抗β-HCG 抗体固定处显示胶体金特有红色，提示试验阳性。尿中无HCG时，溶解的抗α-HCG 至固定有金标二抗的MC膜处显示胶体金特有红色(质控线条)，提示试验阴性。
试剂盒基本单位仅有一滤膜条，只有一步操作。
3. 胶体金颗粒的制备
在氯化金溶液中加入不同的还原剂，可制备出不同大小的金颗粒。常采用柠檬酸、抗坏血酸和白磷。用这三种还原剂可分别制备出大、中、小三种主要胶体金颗粒。目前，有更多的实验室仅以柠檬酸为还原剂，在柠檬酸还原氯化金时，加入不同量的单宁酸即可获得大小不同的金颗粒，所制备金颗粒的大小非常一致。
[1] 以抗坏血酸为还原剂制备10～15nm 直径的胶体金(Au l5) 在一个洗净烤干的250 ml 容量的三角烧瓶中，加入20ml 三蒸去离子水(3DW)、l ml 0.1 mol/L K2CO3和l ml％氯化金水溶液于冰浴中混匀，立即加入l ml 0.7％ 抗坏血酸，并充分摇动至溶液呈紫红色，加3DW 至100ml，100℃水浴5min 后，溶液变成红色，放室温冷却待用。
[2] 以柠檬酸为还原剂制备8～10 nm 直径的胶体金(Au l0) 125 ml 3 DW 煮沸后加入1％ 柠檬酸7.5 ml，再煮沸5 min，迅速加入1.25 ml％氯化金溶液，100℃水浴15 min，溶液置室温待用。
[3] 以柠檬酸为还原剂制备5—6 nm 直径胶体金(Au 6) 将l ml 氯化金加入100ml 3DW 中煮沸，快速加进2．45ml 柠檬酸—单宁酸的混合液(2 ml 1％ 柠檬酸三钠、0.45 ml 1％ 单宁酸)，继续煮沸5 min，放室温待用。
[4] 白磷为还原剂制备5 nm 直径的胶体金(Au 5) 将120 ml 3DW、1.5 ml％氯化金和2.7 ml 1 mol/L K2CO3，混合，缓慢搅拌中快速加进l ml 白磷一乙醚溶液，室温轻搅拌15 min，100℃水浴30 min 后放室温待用。
胶体金制备一般需在中性pH(7.2 左右)条件下进行，也可在稍偏酸或稍偏碱的环境中进行。制备的胶体金其大小和形状可在电镜下观察确定。一般胶体金溶液呈红葡萄酒颜色，大颗粒胶体金是紫红色。正常情况下，胶体金溶液应清澈而不含任何可见的沉淀或漂浮物，如溶液、试剂、瓶皿等不干净。将造成如下结果：
第一不能获得预期大小的胶体金颗粒，第二将影响到下一步生物大分子的吸附过程和包被后胶体金的稳定性。因此，为了获得满意的胶体金，应选择最纯净的各有关试剂和液体。如有条件，所有试剂最好经过超过滤处理，以除去其中的分子聚合体和可能混入的杂质块。制备过程中所用的水以三蒸去离子水最合适，各类
器皿均应严格清洗，盛胶体金的瓶皿先经过硅化则更为理想。胶体金颗粒在吸附生物大分子之前具有一定的稳定性，4℃可存放一周左右，如果经超过滤和透析处理后加0.002％ 叠氮钠，能保存5 个月左右。