免疫金组织化学染色实验——IGSS法

免疫金银染色（immunogold silver staining；IGSS）的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子（Ag），被还原的银原子围绕金颗粒形成一个「银壳」，「银壳」一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使「银壳」越长越大，最终使抗原位置得到淸楚放大。

该方法只有在抗原存在的情况下，才有金颗粒并促使银壳的形成。没有抗原区域就没有抗原-抗体反应，也就不会有颗粒存在，银离子与对苯二酚的反应则很慢，这样光镜下就能看到抗原-抗体反应部位呈黑色或黑褐色。IGSS 方法可提高抗原-抗体反应部位金颗粒的可见度，它是一种简便、特异而敏感的方法。

IGSS 可分直接法、间接法和搭桥法，间接法的放大原理见图 6-5，搭桥法的放大原理见图 6-6。

石蜡切片 IGSS：（冰冻切片见「其他」）

1. 切片脱蜡至水。

2. 0.1％ 胰蛋白酶 37℃ 消化 20 min 或抗原修复 20 min（98℃），自然冷却至室温。

3. 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 3×3 min。

4. 1％ EA（卵蛋白）15 min，不洗。

5. 适当稀释的特异抗体室温 4 h 或 4℃ 孵育 20 h，或 37℃ 孵育 1 h。

6. 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 3×5 min。

7. 0.02mol/L（pH 7.4）TBS（内含 0～1％ BSA）洗 10 min。

8. 1％ EA 15 min，不洗，1:10～1:20 稀释的 PAG 10 nm 室温孵育 1 h，或 37℃ 孵育 30 min。

9. 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 10 min。

10. 1％ 戊二醛洗 10 min。

11. 双蒸水洗 5 min。

12. 1％ 明胶洗 5 min。

13. 银避光显影 8～15 min。

14. 双蒸水洗 15 min。

15. 固定：用显影定影液（1:4 或 1:10）固定 5 min，也可以用 15％ 硫酸钠-20％ 硫代硫酸钠混合液固定 1～3 min，或用 1％ 戊二醛固定 5 min，50℃ 温水洗 3～6 min。

16. 衬染，核固红衬染 3 min 或甲基绿衬染 3 min。

17. 常规脱水，二甲苯透明，常规树胶封片。

18. 镜检：阳性物质呈黑色或黑褐色，颗粒分布于抗原-抗体反应部位；背景较干净，呈红色。

冰冻切片 IGSS

做冰冻切片的组织可先经过固定再作切片，也可先制作冰冻切片，然后再固定。这要根据保存抗原的需要而定，固定过的组织可用含 20％ 蔗糖的 PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）浸泡过夜，使切片减少冰结晶，保持组织细胞良好的形态结构。切片入 0.05 mol/L（pH 7.4）TBS 洗 3×3 min，染色步骤同石蜡切片。