免疫复合物方法检测酪氨酸蛋白激酶

基 本 方案 酪 氨酸 蛋白 激酶 的免 疫 沉淀 和自 身 磷 酸化 检 测

以下步骤可以釆用淋巴或非淋巴细胞、原代细胞或培养的细胞系、活化或非活化的细胞。

材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)

待检测的细胞 冰预冷的 PBS

含蛋白酶抑制剂的 I X 细 胞 裂 解 液（新鲜配置并于冰上保存）

含蛋白酶抑制剂的 5 X 裂 解 液（细胞活化用，新鲜配制并于冰上保存）

考马斯蛋白检测试剂（Pierce) 或类似试剂

多克隆或单克隆的兔抗 src-相 关 T P K 抗 血 清（U B I 、 Oncogene Science 或 Santa
Cruz Biotechnology)

对 照 血 清（Sigma) : 正 常 的 兔 血 清（如使用多克隆抗血清），或 同 型 IgG (如使用
单克隆抗血清）

Pansorbin ( 1 0 % 福 尔 马 林 固 定 的 金 色 葡 萄 球 菌 ； Calbiochem) ， 或 蛋 白 A /蛋白
G-Sepharose (Pharmacia Biotech)

亲和纯化的兔抗鼠 IgG (如使用单克隆抗体； Organ o n T e k n i k a C a p p e l)

冰预冷的 N P -40 缓冲液

冰预冷的酪氨酸蛋白激酶（T P K ) 缓冲液

l 〇/mi 〇 l/L A T P 溶液，新鲜配制

5m C i / m l [y-32P ] A T P (3000Ci/m m o l ; D u P o n t N E N ) : 在准备反应混合物前
一小时将其在冰上融化

冰预冷的改良 R I P A 缓冲液

I X S D S /上样缓冲液

细 胞 刮 具（用于贴壁细胞）

Labquake 摇 床（PGCScientific)

l 〇〇°C 加热块

W h a t m a n 3M M 滤纸

注 ：除洗涤外，所有的步骤均在冰上或 4°C 冷室进行。
收 集 无 需 活 化 的 细 胞 。

la. 对于悬浮细胞，需室温， 500 g 离 心 I O m i n 收集 ，弃上清，以冰预冷的 P B S 重悬细
胞 。如前所述离心和弃上清。对于贴壁细胞，当 细 胞 贴 壁 时 以 5〜I O m l 冰预冷的
P B S 洗一次，旋动并吸弃 P B S 。于 IO7〜IO8 个 细 胞 加 2〜3m l 冰 P B S ，以细胞刮具
收集细胞。如前所述悬浮细胞的条件离心。如有必要，于一 70°C 保存细胞沉淀，细
胞裂解物不能冰冻（步 骤 5)。

2a. 加 入 I m l 冰预冷的含蛋白酶抑制剂的 I X 细胞裂解液并涡旋混匀，冰上静置 lOmin。
收 集 不 同 时 间 进 程 的 活 化 细 胞 。

备 选 方 案 1 蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测

附 加 材 料

备 选 方 案 2 蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测

附加材料