木 瓜 蛋 白 酶 水 解 IgG 成 Fab 片段摸索性试验此 法 适 用 于 小 鼠（任何亚类）、大鼠、人 、山羊、绵羊、马 、鸡 、豚 鼠 和 牛 的 IgG水解。 材 料保存于 PBS (附录 1 ) 中 的 2 mg/ml 纯 化 的 IgG (单 元 1.5) 木 瓜 蛋 白 酶（2 X 结晶悬液； Sigma) 水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二 钠 盐 ）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制 ，冰上保存< l0h) 溶 于 PBS 的 0.3mol/L 碘 乙 酰 胺（从结晶体新鲜配制； Sigma) PBS 自制的微量透析槽或微量透析盒（如 Slide-A-Iyzer 透析盒； Pierce) 1.将 IOOud 2 mg/m l 纯化的 IgG 加入标有 1〜2 4 的 24 个微量离心管中。充分混匀木瓜蛋白酶悬液，不能振荡。准备两种浓度木瓜蛋白酶，溶 于 5m l 水解缓冲液中，浓度分别是 0.lmg/ml 和 0 .02 mg/ml。 2.将 100ul 0.1 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入 8 个 IgG 离 心 管 中（酶/抗体比例为 1 : 2 0 ) ，将 IOOmI 0. 02 mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入第二组 8 个 IgG 离 心 管 中（酶/抗体比例为 1 : 1 0 0 ) ，最后，将 IOOmI 不含木瓜蛋白酶的水解缓冲液加入剩余的 8 个 IgG 离心管 中（对照组），所有离心管盖上盖子。 3.将所有离心管置于 37°C 水 浴 ，在不同时间取出一组离心管，制作水解时间曲线图。一组离心管指一个 E/A 比为 1 : 2 0 的水解管，一 个 E/A 比 为 1:100 的水解管和一个对照水解管。水 浴 Ih 时取出第一组离心管，接着在第 2 h、 4 h、 6 h、 12 h、 18 h、 24 h 和48 h 分别取出第二至第八组离心管。取出一组离心管后每管加入 20M1 0. 3mol/L 碘乙酰胺中止水解。 4.用自制的微量透析槽或商品化的微量透析盒将水解混合物对 PBS 透析。 5.用 150 mmXl.5 mm 1 0 % 非还 原 SDS-聚丙烯酰胺 凝 胶 电 泳（单 元 12. 3 ) 分析水解产物 ，上 样 量 为 80M 1。当 凝 胶 上 在 150kDa (表示未水解的抗体）和 120kDa (表示仅半胱氨酸起作用）处没有显示蛋白质条带时，酶切反应完全。选 择 水 解 IgG 获取Fab 片段的最佳试验条件，按基本方案 2 进行试验。Fab 片段大小为 5 〇 kDa 左右， Fc 片段大小为 27kDa，在 24kDa 和 15kDa 处的细条带是一些不重要的水解产物。 木瓜 蛋白 酶 水解 IgG 获 取 Fab 片段的大量制备用摸索性试验的方法确定获取 Fab 片段的最佳试验条件（见基本方案 1)。 材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)木 瓜 蛋 白 酶（2 X 重结晶悬液； Sigma) 水解缓冲液：0.02mol/LEDTA (二钠盐）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制，冰上保存< l0h) 溶 于 PBS (附录1 ) 中浓度> lmg/m l的 IgG (总量> 5 mg，单 元 1. 5) 碘乙酰胺结晶 P B S ， p H 8. O 蛋 白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B 聚丙婦酰胺葡聚糖 S-200 Superfine (Pharmacia Biotech) V 硼酸盐缓冲液，可选 1 0 % (m/V) NaN3，可选 5 mmX IOOmm 层 析 柱（Bio-Rad) 26 mmX 900 mm 层 析 柱 (Pharmacia Biotech) 1.混匀木瓜蛋白酶悬液，避免振荡。加入与待水解抗体相等体积的水解缓冲液溶解木瓜蛋白酶，选择从摸索性试验中已确定的最佳酶量、抗体浓度和孵育时间进行实验。 2.将 木 瓜 蛋 白 酶 液 加 入 浓 度 为 溶 于 PBS 的 IgG 中，混 匀 ， 37°C 水浴至所需时 间（从基本方案 1 中确定）。加入结晶碘乙酰胺至终浓度0.03mol/L 中止水解反应 ，小心混勻，确保碘乙酰胺完全溶解。 3.将反应液转至透析袋中（CPI 附 录 3 H) ，在 4°C 下 对 2LPBSpH8.0 透 析 12〜20 h。 4.准 备 5 mmX100 mm 蛋 白 A 交联琼脂糖凝胶 CL-4B 层 析 柱（单 元 1.5、 CPI 附 录 31)，将透析液上样。收集含有 Fab 片段和酶的未结合流穿液。如有需要，用 PBS 充分洗柱 ，收集所有 Fab 片段。 5.将 含 有 Fab 片段的流穿液浓缩至≤5 ml (CPI 附 录 3 H)。 6.将浓缩液上样至 26 mmX 900 mm聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200 Superfine 层析柱，收集分子质量大小为50kDa 的组分，用 SDS-PAGE 法鉴定分子质量大小或使用预平衡的凝胶过滤层析柱。 7.将 1〜80M 1终产物用1 0 % 非 还 原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定终产物的纯度。通过测定A280值 ，确 定 Fab片 段 浓 度（表 1.5.1)。将 Fab片段保存在硼酸缓冲液中，于 4°C 保存；或者保存在含0• 02%NaN3 的 PBS 中，于一 70°C保存。 胃蛋白酶水解 IgG 成 F (ab’)2片段的摸索性试验
胃蛋白酶水解IgG 获 取 F (al/)2 片段的大量制备
备 选 方 案 用 预 先 活 化 的 木 瓜 蛋 白 酶 水 解IgG 制 备 F (ab)2
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