全二维气相色谱柱组分类标准化协议的开发

一维气相色谱 (1D-GC) 固定相通常根据其相对极性分为非极性、半极性和极性柱。在全二维气相色谱 (GC×GC) 中，两个串联组装固定相之间的极性差异决定了色谱柱组合的选择性。这种极性差异称为正交性，GC×GC 色谱柱组可根据主色谱柱和次色谱柱之间串联耦合的方向大致分为四类。目前使用的 GC×GC 色谱柱组中很大一部分以正向正交性操作模式，这意味着次级柱比主柱极性更强。越来越多的报道的 GC×GC 应用在反向正交配置中运行，其中次级柱的极性小于主柱。非正交柱组的例子很少，因为当两个相相同或极性接近时，次级柱可以提供的额外选择性有限，而主柱已经实现了分离。第四组 GC×GC 柱组称为混合正交，涉及固定相与特殊选择性差异的耦合，这些差异在二维分离图中表现出来。在这项工作中，我们提出了一种标准化的 GC×GC 柱组表征方法，该方法基于使用称为 Century Mix 的标准参考混合物。Century Mix 包含 100 种具有不同功能的化学探针，这些探针涵盖了合理的挥发性和极性范围，以捕获任何 GC×GC 柱组的选择性特征。Century Mix 还包含用于 1D-GC 柱表征的重要化学探针（例如 Grob 混合物和 Rohrschneider/McReynolds 化合物），以在 1D-GC 构建块柱和 GC×GC 柱组之间建立一些联系。最后，我们还概述了评估 GC×GC 系统的整体性能时应考虑的一些其他重要的比较指标。

任何色谱方法的目标 都是在尽可能短的时间内完全分离所有目标分析物，并具有良好的峰形属性。因此，色谱柱的选择是方法开发工作流程中非常重要的决定，而固定相的分类有助于这一过程。在一维气相色谱 (1D-GC) 中，固定相的选择性和性能特征通过常用的混合物提供，例如 Rohrschneider/McReynolds 化合物或 Grob 测试化合物 (1,2)。这些混合物含有化学探针，可提供有关固定相相对极性的信息，其中极性被定义为溶质和固定相之间发生的多种特定相互作用（静电偶极子、氢键、电子给体-受体以及离子或共价键形成）的综合效应。

全二维气相色谱 (GC×GC) 的选择性优势在于，通过结合两种偶联固定相的特性，可以提高分离能力。此外，GC×GC 分离是结构化的，二维 (2D) 轮廓图色谱图可被认为是显示两个主要梯度的图 - 主要维度是挥发性梯度轴，次要维度是极性梯度轴。这就是为什么 GC×GC 色谱图通常具有具有相似官能团的化合物的可辨别模式，这在非目标分析中非常有用，可用于在用分析标准确认未知化合物之前对其进行推定鉴定 (3)。

由于可能存在大量组合，因此对所有可能的 GC×GC 色谱柱组进行详尽分类并不实际。但是，可以根据所耦合固定相的相对极性将 GC×GC 色谱柱组分为几组，如图 1a 所示。对 2023 年 140 篇同行评审出版物的调查（使用 SciFinder Scholar 中的关键词“综合二维气相色谱”）表明，相当一部分 GC×GC（55%）项目以“正向”（或“正常”）正交模式运行，其中主色谱柱的极性低于次色谱柱。这些色谱柱组合包括图 1a 中的非极性/半极性（39%）、非极性/极性（16%）和半极性/极性（0%）部分。但是，值得注意的是，“反向”正交配置（半极性/非极性、极性/非极性和极性/半极性）的数量显著增加（44%），是 Focant 和 Stefanuto 上次审查的三倍多，上次审查报告了此类调查（4）。这是一个积极的趋势，因为这意味着 GC×GC 方法开发人员开始使用更多可用的选择性。图 1b 显示了来自相同调查数据的应用领域饼图。食品和风味方法似乎正在兴起（占报告工作的 40%），石化、环境和生物分析应用之间保持着良好的平衡。还应注意，所有这些应用领域都使用了正向和反向正交柱组，并且，GC×GC中色谱柱组的选择更多地取决于被分离分析物的性质和多样性（就功能组而言），而不是应用领域。

图1：2023年GC×GC同行评审出版物调查结果：（a）列集分类；（b）应用领域分类。

人们普遍认为，GC×GC 分离的质量取决于极性差异（称为正交性) 在主色谱柱和副色谱柱之间的正交性很高，因此，归类为非正交的色谱柱组（图 1a 中的非极性/非极性、半极性/半极性和极性/极性）没有其他组合使用得那么频繁也就不足为奇了。然而，非正交 GC×GC 系统的演示确实存在，而且当目标分析物（由于热或化学过程）在柱上转化为相关物种是该方法的分析策略的一部分时，这种演示似乎是合理的。Marriott 及其同事最近报道了使用 Rxi-1 MS/DB-5 色谱柱组合监测热异构化反应中的除虫菊酯异构体 (5)。在极性尺度的另一端，2013 年，Delmonte 及其同事展示了如何使用 SLB-111/SLB-111 色谱柱组通过在调节器中使用柱上加氢来分离脂肪酸甲酯 (6)。还应注意，当连接极性差异很大的色谱柱时，一个固定相上分析物的峰形可能会受到另一个固定相上的影响，从而降低有效分离度和检测限。出于这些原因，重新理解 GC×GC 中的正交性和选择性概念非常重要。我们坚信还有更多相关的色谱柱组合值得探索，这项工作的目标是开发一种标准的化合物混合物，以帮助更好地对可能的 GC×GC 色谱柱组合网格进行分类。

世纪组合

尽管多年来石油基样品（如汽油、柴油或喷气燃料）一直用于表征 GC×GC 系统，但为了进行更有效的比较，更理想的是使用更标准化的混合物。2003 年，为此开发了一种 80 种化合物的混合物，它是 Grob 混合物的扩展，以更好地覆盖二维化学空间 (7)。这种混合物被称为菲利普斯混合物，以纪念已故的约翰·B·菲利普斯教授（GC×GC 的发明者）。多年来，出于各种原因，这种混合物不断被修改，例如去除可能降低整体混合物稳定性的化合物或添加化合物以捕获更合理的二维化学空间部分。目前提出的混合物含有 100 种化合物，称为Century 混合物（混合物中化合物的功能概述见表 I）。尽管这种混合物目前尚未在市场上销售，但美国食品药品管理局 (FDA) 和美国国家标准与技术研究所 (NIST) 正在支持一项跨机构合作，以开发这种混合物，从而根据目前市场上存在的多种不同 GC×GC 仪器变体来标准化仪器性能指标。

使用此标准混合物的一个重要组成部分是操作条件的标准化。在开发的现阶段，正在使用热调制仪器，这里报告的参数适用于这些系统。该混合物适用于所有 GC×GC 系统，并计划为此评估进行实验室间研究。使用氦气作为载气，流速为 1.0 mL/min。在分流/不分流系统（使用 100:1 分流）上进行注射，注射量为 1 µL。主柱尺寸为 30 m 长，内径为 250 μm，膜厚为 0.25 µm。次柱尺寸为 2 米长，内径为 250 µm，膜厚为 0.25 µm。主柱温度程序从初始温度 40 °C 开始，持续 2 分钟，然后以 5 °C/min 的速率升温至 230 °C 并保持 10 分钟。分析运行时间为 50 分钟，辅助柱箱的编程速率比主柱箱高 5 °C。调制器温度偏移比主箱高 15 °C，热脉冲时间为 0.6 秒。根据保留最多的分析物的洗脱时间调整调制周期以避免任何环绕峰。进入飞行时间质谱仪 (TOF-MS) 的传输线温度为 280 °C，以 100 张光谱/秒的速率收集光谱，范围在 35 至 500 amu 之间。离子源温度为 225 °C，电子电离能为 70 eV。并且次级柱温箱的升温速度比主柱温箱高 5°C。调制器温度偏移比主柱温箱高 15°C，热脉冲时间为 0.6 秒。调制周期根据保留时间最长的分析物的洗脱时间进行调整，以避免出现任何环绕峰。进入飞行时间质谱仪 (TOF-MS) 的传输线温度为 280°C，在 35 至 500 amu 的范围内以 100 光谱/秒的速率收集光谱。离子源温度为 225°C，电子电离能为 70 eV。并且次级柱温箱的升温速度比主柱温箱高 5°C。调制器温度偏移比主柱温箱高 15°C，热脉冲时间为 0.6 秒。调制周期根据保留时间最长的分析物的洗脱时间进行调整，以避免出现任何环绕峰。进入飞行时间质谱仪 (TOF-MS) 的传输线温度为 280°C，在 35 至 500 amu 的范围内以 100 光谱/秒的速率收集光谱。离子源温度为 225°C，电子电离能为 70 eV。调制周期根据保留时间最长的分析物的洗脱时间进行调整，以避免出现任何环绕峰。进入飞行时间质谱仪 (TOF-MS) 的传输线温度为 280 °C，光谱收集速率为 100 光谱/秒，范围在 35 至 500 amu 之间。离子源温度为 225 °C，电子电离能为 70 eV。调制周期根据保留时间最长的分析物的洗脱时间进行调整，以避免出现任何环绕峰。进入飞行时间质谱仪 (TOF-MS) 的传输线温度为 280 °C，光谱收集速率为 100 光谱/秒，范围在 35 至 500 amu 之间。离子源温度为 225 °C，电子电离能为 70 eV。

图 2a 显示了 Century 混合物在正向正交性色谱柱组上的等高线图色谱图，其中主色谱柱为 Rxi-5Sil MS 主色谱柱（30 m，250 µm 内径，0.25 µm 膜），连接到 Rxi-17Sil MS（2m，250 µm 内径，0.25 µm 膜）次级色谱柱。主色谱柱分离范围以 C ₆（己烷）和 C _{20之间的烷烃（在色谱图底部洗脱）为标志}（二十烷）。第二柱梯度的方向以芳香烃（苯、萘和菲）为标志，这些化合物在第二维时间增加时被洗脱，这表明第二柱极性高于第一维极性。柱组的选择性可以通过同源化合物系列的洗脱顺序来描述。在这种情况下，洗脱顺序如下：烷烃<烯烃<仲醇<伯醇<脂肪酸<羧酸<酮<烷基苯<内酯<邻苯二甲酸酯。混合物中所有化合物的峰形似乎相当对称，这表明分离效果可接受。除了这些基本的比较参数外，Century 混合物中的其他探针用于建立与 1D-GC 指标以及其他性能指标（例如峰形和二维化学空间的有效利用）的联系，但本文不会详细讨论这些内容。

图 2：两组正向正交色谱柱的 GC×GC 轮廓图色谱图，附有峰顶图，其中识别出一些同源系列（对于芳香烃化合物，B 为苯，N 为萘，P 为菲）。主轴和次轴的保留时间以秒为单位。（a）Rxi-5Sil MS/Rxi-17Sil MS 色谱柱组合；（b）ZB-5 MS/VF-200 色谱柱组合。

图 2b 显示了 Century 混合物在与图 2a 中所示的不同正向正交性色谱柱组上的等高线图色谱图。在这种情况下，主色谱柱是 ZB-5MS 色谱柱（30 m，250 µm 内径，0.25 µm 膜），连接到 VF-200（2 m，250 µm 内径，0.25 µm 膜）辅助色谱柱。尽管两种色谱柱都属于“非极性/半极性”类别，但图 2b 中产生的 2D 分离梯度与图 2a 中的不同，这意味着第二组色谱柱的选择性与第一组色谱柱略有不同。选择性差异的一个明显指标是同源系列的洗脱顺序，如下所示：烷烃 < 烯烃 < 烷基苯 < 一级醇 < 二级醇 < 羧酸 < FAMES < 酮 <邻苯二甲酸酯 < 内酯。值得注意的是，同一分类类别的色谱柱的洗脱顺序发生了变化，因为这表明 GC×GC 中的选择性并不局限于给定的一般固定相类别，这些梯度应该更详细地研究。既然我们可以监测 Century 混合物中所有目标分析物的色谱图之间的差异，研究使用不同操作参数可以产生的选择性的其他变化也将很有趣。既然我们可以监测 Century 混合物中所有目标分析物的色谱图之间的差异，那么研究通过不同的操作参数可以产生的选择性的额外变化也将很有趣。既然我们可以监测 Century 混合物中所有目标分析物的色谱图之间的差异，那么研究通过不同的操作参数可以产生的选择性的额外变化也将很有趣。

预测 GC×GC 色谱图

过去几年中，有几个研究小组致力于 GC×GC 的预测建模 (8–12)。在本文中，我们将介绍一种非常简单的方法来生成预测性 GC×GC 图，这可能有助于查看可能尚未尝试但可能提供一些有趣的选择性选项的色谱柱组合。此方法的唯一要求是在本文第 2 部分描述的操作条件下对目标固定相生成两个色谱图。将针对给定的一组目标分析物和一组烷烃获得这些色谱图，以计算每种化合物的保留指数值，如表 II 所示。预测色谱图表示第一根色谱柱的程序升温保留指数和第二维中的特定指数 (ΔI)，后者通过从第二根色谱柱的保留指数中减去第一根色谱柱的保留指数而获得。预测 GC×GC 图表示二维平面中的相对位置（而不是精确的保留时间），它们有助于确定哪些色谱柱组合可能提供一些有趣的选择性。在比较不同的色谱柱组时，这些图还可以为一组目标分析物的化学空间占用情况提供有价值的视觉估计。对于那些在无法使用仪器的实验室中评估 GC×GC 的潜在效用的个人来说，这些预测图的价值非常重要。这是通过从第二根色谱柱的保留指数中减去第一根色谱柱的保留指数而得到的。预测性 GC×GC 图表示的是 2D 平面中的相对位置（而不是精确的保留时间），它们有助于确定哪些色谱柱组合可能提供一些有趣的选择性。在比较不同的色谱柱组时，这些图还可以提供一组目标分析物化学空间占用的宝贵视觉估计。这些预测图的价值对于评估无法使用仪器的实验室中 GC×GC 的潜在效用的个人来说非常重要。这是通过从第二根色谱柱的保留指数中减去第一根色谱柱的保留指数而得到的。预测性 GC×GC 图表示的是 2D 平面中的相对位置（而不是精确的保留时间），它们有助于确定哪些色谱柱组合可能提供一些有趣的选择性。在比较不同的色谱柱组时，这些图还可以提供一组目标分析物化学空间占用的宝贵视觉估计。这些预测图的价值对于评估无法使用仪器的实验室中 GC×GC 的潜在效用的个人来说非常重要。预测性 GC×GC 图表示的是 2D 平面中的相对位置（而不是精确的保留时间），它们有助于确定哪些色谱柱组合可能提供一些有趣的选择性。在比较不同的色谱柱组时，这些图还可以提供一组目标分析物化学空间占用的宝贵视觉估计。这些预测图的价值对于评估无法使用仪器的实验室中 GC×GC 的潜在效用的个人来说非常重要。预测性 GC×GC 图表示的是 2D 平面中的相对位置（而不是精确的保留时间），它们有助于确定哪些色谱柱组合可能提供一些有趣的选择性。在比较不同的色谱柱组时，这些图还可以提供一组目标分析物化学空间占用的宝贵视觉估计。这些预测图的价值对于评估无法使用仪器的实验室中 GC×GC 的潜在效用的个人来说非常重要。在比较不同的色谱柱组时，这些图还可以提供一组目标分析物化学空间占用的宝贵视觉估计。这些预测图的价值对于在没有仪器的实验室中评估 GC×GC 潜在效用的个人来说非常重要。在比较不同的色谱柱组时，这些图还可以提供一组目标分析物化学空间占用的宝贵视觉估计。这些预测图的价值对于在没有仪器的实验室中评估 GC×GC 潜在效用的个人来说非常重要。

图 3a 显示了“混合”正交性色谱柱组的预测图，该图由 Rtx-17 第一维色谱柱和 VF-200 第二维色谱柱获得（该图使用了表 II 中为全套 Century Mix 化合物生成的数据）。这两种色谱柱都被认为是半极性的，传统上不会认为它们足够“正交”而无法用于 GC×GC。从表 II 中的 ΔI 数据可以看出，烷烃的上方和下方都有值，这在 GC×GC 色谱图中并不常见。正向正交性系统通常将烷烃置于色谱图底部（保留最少），而反向正交性系统将烷烃置于色谱图顶端（保留最多）。然而，在 2012 年，Seeley 及其同事展示了一个使用两种半极性固定相（DB-210/HP-50 组合）进行分离的实例，该实例能够将脂肪酸甲酯 (FAME) 杂质从石油样品中分离出来 (13)。FAME 化合物在色谱图底部与石油样品的其余部分有选择性地分离，这是一个非常不寻常的结果。使用 Century 混合化合物，我们观察到了类似的结果，只是在这种情况下，同源系列的烷基苯和烯烃在烷烃下方洗脱。FAME 化合物实际上在烷烃上方洗脱，因为三氟丙基固定相是次级色谱柱，并且与 Seeley 色谱柱组具有相反的选择性，其中三氟丙基固定相用作主色谱柱。

图 3：反向混合正交柱组上的 GC×GC Century 混合分析。（a）预测图，其中识别出一些同源系列（对于芳香烃化合物，B 为苯，N 为萘，P 为菲）；（b）峰顶图，其中识别出一些同源系列。主轴和次轴的保留时间以秒为单位；（c）等高线图色谱图。主轴和次轴的保留时间以秒为单位。

图中还正确预测了其余同源化合物系列的洗脱顺序（如图 3b 所示）。图 3c 显示了 GC×GC 色谱图的实际轮廓图，尽管由于除同源化合物系列外还存在许多其他化合物，因此目标分析物的身份更难辨别。为了应对以前未尝试过的色谱柱组合中可能出现的异常保留模式，我们准备了一组确认混合物，这些混合物可以单独运行，以便在必要时分离特定的功能。当使用单通道检测器（如火焰离子化检测器 [FID]）时，这些完整混合物的子集也很重要，因为单通道检测器无法提供质谱仪 (MS) 能够生成的有关峰身份的额外信息。内标（喹啉）也是一种可用的化合物，可以将其添加到 Century 混合物中以生成信号比信息，这在比较不同检测器的信号强度时非常有用。这类信息在评估新合成固定相的潜力时非常有用，例如 Ryoo、Anderson 及其同事最近报道的聚合物离子液体相 (14)。内标（喹啉）也是一种可用的化合物，可以将其添加到 Century 混合物中以生成信号比信息，这在比较不同检测器的信号强度时非常有用。此类信息在评估新合成固定相的潜力时非常有用，例如 Ryoo、Anderson 及其同事最近报道的聚合物离子液体相 (14)。内标（喹啉）也是一种可用的化合物，可以将其添加到 Century 混合物中以生成信号比信息，这在比较不同检测器的信号强度时非常有用。此类信息在评估新合成固定相的潜力时非常有用，例如 Ryoo、Anderson 及其同事最近报道的聚合物离子液体相 (14)。

结论

为了改进方法开发的分析策略，我们需要更好地理解 GC×GC 化学空间第二维中起作用的分离梯度。我们希望这种标准化混合物的开发将有助于提高我们对色谱柱选择性的认识，我们计划研究更多的色谱柱组，以进一步了解 GC×GC 中正交性和分离效率之间的关系。我们还坚信，需要针对各种固定相开发一个在标准操作条件下获得的保留指数信息数据库，以帮助完成色谱柱选择任务。该数据库还应提供有关标称浓度下的峰不对称性和峰宽等指标的信息，以帮助开发下一代 GC×GC 预测模型。

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