全自动生化分析仪测定血清总胆汁酸的应用研究

总胆汁酸(TBA)是胆固醇代谢的产物，其生成和代谢与肝脏有十分密切的关系。它的测定对慢性肝病、肝硬化、酒精性肝病以及胆汁淤积的诊断、预后和疗效评估方面往往优于多项肝酶学指标，因此具有重要的I临床应用价值。随着I临床检测方法从过去繁琐的高效液相色谱法逐渐发展为方便适用的循环酶速率法，该方法值得推广和应用。
1 对象和方法
    1．1 对象健康人对照组150例，为门诊健康体检者：经过实验室肝、肾、心功能血清学检测，B超和临床检查未见异常者，其中男80例，女70例，年龄20～65岁。标本采集：采集上述人群空腹静脉血，离心分离血清备用。
    1．2 试剂和仪器TBA试剂购于浙江东瓯生物工程有限公司，注册号2005第3400888号，标准品(C标 )含量100umol/L；质控品采用罗氏CFAS校准品；仪器为0LYMPUS AU-400型全自动生化分析仪，检测前先进行仪器的管道和冲洗系统保养，并将石英比色杯全部取出，用超声波进行彻底清洗，重装仪器后再进行W2冲洗程序并进行光电校准。

1．2 方法
    1．2．1 精密度实验 收集新鲜混合血清一份进行批内、批间测定。批内精密度实验：将混合血清重复测定20次，然后计算其平均值及变异系数；批间精密度实验：将混合血清分成20份，放置-20℃条件下保存。然后每天取出一份标本复溶至室温后对TBA进行测定，然后计算其批间测定TBA结果的平均值及变异系数；将批内与批间结果进行标本均数差异显著性比较。
    1．2．2 线性实验 将标准品含量为100umol/L的TBA用0.95%氯化钠溶液稀释成10、25、50、75umol/L不同浓度的TBA样品，用这四个稀释好的标准品和标准品原液建立TBA标准曲线；把5个不同浓度的TBA样品，每一个样品重复测定3次，记录他们的吸光度值的平均值；以吸光度的变化(△A/min)为横坐标，TBA浓度为纵坐标，用Microcal Origin 6.0软件绘制标准曲线图。
    1．2．3 回收实验在混合血清中分别加入50umol/L和100umol/L浓度的TBA标准品。计算它们的理论浓度，然后再测定它们的真正结果，最后用真正测得的结果与其理论值比较计算它们的回收率。
1．3 TBA循环酶速率法仪器分析主要参数检测方法为速率法(kinetic with starter)，主波长410 nm，副波长660 nm，反应温度37℃，方向是正方向，标本用量2u l，第一试剂180u l，第二试剂60u l；反应读点分别是14和20，计算式为：胆汁酸浓度(~mol/L)= (△A/min标本-△A/min标本)×C标准/(△A／min标准-△A/min空白)。 本文来自检验地带网 
1．4 统计学处理对测定的结果进行不精密度及标本均数的比较，全部数据均使用SPSS 10.0统计学软件进行分析处理 。
2 结果
2．1 精密度结果及批内批间结果比较批内、批间精密度结果(umol/L)及变异系数分别是7.85士0.21、2.67%，7.88士0.2、2.54 。批内、批间结果比较t-0.319、P-0.751，可看出批内与批间测定结果比较差异无显著性。
2．2 回收率结果 在混合血清中分别加入50umol/L和100umol/L浓度的TBA标准品，混合血清实际测得TBA结果是7.43umol/L，在混合血清中加入等体积50~mol/L和100umol/L浓度的标准品后TBA理论含量数值分别为(7.43士50)／2—32.43umol/L和(7.43士100)/2—57.43umol/L；仪器实际测得TBA结果分别是：32.66和60.06umol/L，最后通过计算可得出循环酶速率法测定血清TBA的平均回收率分别是99.28%和95.61 。
2．3 线性实验 结果见图1。吸光度的变化(Rate of Ab—sorbance，△A/min)为横坐标，TBA浓度(umol/L)为纵坐标
2．4 实验室参考值的建立对150例门诊健康体检者作TBA
测定平均值士标准差(umol/L)为4.355=2.25，因此我实验室参考范围设定为<10.0umol/L。
3 讨论
    本文采用循环酶速率法测定血清TBA的原理是胆汁酸被3a-羟基类固醇脱氢酶及 硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD+)特异性的氧化，生成3酮类固醇及硫代烟酰胺还原型胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)；生成的3酮类固醇在3a-羟基类固醇氢酶及还原型腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下生成胆汁酸和氧化型腺嘌呤二核苷酸(NAD)；如此循环往复从而放大微量的胆汁酸量，测定生成硫代烟酰胺还原型腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)每分钟吸光度的变化，最后计算出血清TBA含量。 
    过去我们常用的酶比色法通常会产生兰色染料而污染比色杯，且大多数自动生化分析仪无法去除样品空白的干扰，而循环酶速率法不用去除样品空白，具有速度快、方法简便、对仪器管道无污染、灵敏度高 ]的优点，值得推广应用。