激光扫描共聚焦扫描仪的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT)，再经过信号处理，在计算机监视屏上形成图像。对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚，可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距离越大，样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少（由10%到1%，慢慢接近为0%），因而在探测器上产生的信号就越小，影响也越小。正由于共焦显微仅对样本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干扰，使得它具有比普通显微镜更高的分辨率，并在生物学中获得了广泛的应用。