蛋白质的分离纯化可根据蛋白质分子的大小、电荷量、溶解度以及亲和性结合部位的有无，建立许多分离纯化的方法。常用的有离心分离、沉淀分离、透析法、超滤法、层析分离、膜分离以及酶法分离等。这些分离纯化蛋白质的方法各有利弊。
1、离心分离
离心分离是利用不同物质之间的沉降系数或浮力密度等差异，用离心力场进行的一项分离、浓缩或提炼的物理分离分析技术。
2、沉淀分离
沉淀分离是使用最广泛的酪蛋白组分分离技术，它主要是利用各酪蛋白组分在不同浓度溶液中的溶解性以及对温度、离子强度以及钙离子的敏感性差异而实现分离。根据酪蛋白组分在不同浓度尿素溶液中的溶解度差异，Hipp 等人于 1952 年首次实现了对牛乳 β-CN 和α-CN(包括 αs-CN 和 к-CN)分离，得率分别为 8 %和 45 %。Aschaffenburg等人于 1963 年结合等电点沉淀与尿素沉淀，对 Hipp 的方法进行了改进实验，获得了纯度更高的β-酪蛋白。
3、层析分离
层析法又称色谱法，是一种物理化学分离分析方法，是利用混合物中各组分物理化学性质差异，使各组分不同程度分布在固定相和流动相中，由于各组分受力不同从而使各组分以不同速度移动达到分离。用于酪蛋白组分纯化分离的色谱技术主要有离子交换色谱，疏水层析，吸附色谱，凝胶色谱，共价色谱以及亲和色谱等。Thompson 于 1966 年使用 DEAE-纤维素，用 pH=7 的含巯基乙醇和尿素的缓冲液，采用氯化钠进行梯度洗脱，成功分离出酪蛋白组分。Bramanti 等人于 2001 年，使用苯基分离了牛奶蛋白质，蛋白样品用 4 mol 硫氰酸胍进行处理，在 30 min 内从高盐浓度的缓冲液(pH =7.2，含 1.8 mol 硫酸铵和 8 mol 尿素的 0.1mol 磷酸缓冲液)线性降低为低盐浓度的缓冲液状态(含 8 mol 尿素的磷酸缓冲液)，实现了对 as-酪蛋白，β-酪蛋白和 к-CN 的分离。
4、酶法分离
酶是一种生物催化剂，能通过改变反应的活化而加快或降低反应速度，它本身不参与反应，不改变反应的平衡点，因其具有高效性、转移性、温和性等特点，被广泛应用与食品工业中。Huppertz 等人利用 β-酪蛋白和 αs-酪蛋白在低温的酸性条件下溶解度的不同，于 2005 年使用凝乳酶实现了对 β-酪蛋白的富集分离。
5、膜分离
膜分离是根据生物膜对物质选择性通透的原理所设计的一种对包含不同组分的混合样品进行分离的方法。膜分离技术具有分离、纯化、精制以及浓缩蛋白的功能，既高效环保又易于操作，已成为一种重要的分离技术，并广泛应用于食品药品、生命科学、化工冶金等重要领域，具有很高的社会效益和经济效益。Agronomique 等人于 1986 年应用微滤技术生产了 β-酪蛋白。Akgol 于 2008 年，用聚酰胺纤维膜和活性绿-4B 染料制成亲和膜，在 pH=5 条件下吸附初步纯化的 β-酪蛋白，之后用含 1.0 mol 氯化钠或含 0.5 mol 硫氰酸钠的 Tris-HC1 缓冲溶液进行梯度洗脱，成功获得了纯度更高的 β-酪蛋白。