【低分子量肝素的鉴别】
(1)取低分子量肝素适量,加水制成每1ml中约含1000IU的溶液,加5%盐酸溶液2ml和1%吲哚 乙醇溶液0.2ml,水浴加热5分钟,应显橙黄色或橙红色。
(2)取低分子量肝素,照(附一)和(附二)效价测定法测定,抗Xa因子效价和抗IIa因子效价比值不得少 于 1.5。
(3)低分子量肝素的水溶液显钙盐的鉴别反应(中国药典2005年版二部附录Ⅲ)。
【低分子量肝素的检查】
1、酸碱度: 取低分子量肝素0.10g,加水10ml溶解后,依法测定(中国药典2005年版二部附录VI H),pH值应为5.5〜8.0。
2、溶液的澄清度与颜色: 取低分子量肝素适量,加水制成每1ml中约含5000IU的溶液,应澄清无色;如显色,与黄色2号标准比色液(中国药典2005年版二部附录Ⅸ A第一法)比较,不得更深。
3、吸光度: 取低分子量肝素,加水制成每1ml中含4mg的溶液,照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)测定,在260nm的波长处,其吸光度不得大于0.20;在280nm的波长处,其吸光度不得大于0.15。
4、亚硝酸盐: 取低分子量肝素0.20g,加水10ml使溶解,取上述溶液1滴置白瓷板,加对氨基苯磺酸-α萘胺试液1〜2滴,30秒内不应显紫红色。
5、氮: 取低分子量肝素,照氮测定法(中国药典2005年版二部附录Ⅷ D 第二法)测定,按干燥品计算,含总氮量应为1.5%~2.5%。
6、硫酸根离子与羧酸根离子摩尔比: 取低分子量肝素约0.1g,加水20ml溶解后,吸取2ml通过阳离子交换树脂柱(约10cm×1cm),以10〜15ml水缓缓洗人滴定容器,进行电导滴定,每次加氢氧化钠滴定液 (0. 05mol/L)约50μl,直至终点。以电导率为纵坐标,以滴定液的体积为横坐标,绘制曲线。分別对突 然下降,稍微爬升,急剧上升的三个线性部分图形作出最佳直线。在第一条直线和第二条直线,第二条直线和第三条直线的交点,分别对橫坐标作垂直线,第一条和第二条直线交点的垂足是硫酸根消耗氢氧化钠滴定液(0.05mol/L)的毫升数(V1),第二条和第三条直线交点的垂足是硫酸根和羧酸根共同消耗氢氧化钠滴定液(0.05mol/L)的毫升数(V2),V2-V1是羧酸根消耗的氢氧化钠滴定液毫升数,分别计算硫酸根离子与羧酸根离子摩尔数,其摩尔比不得小于1. 8。
7、分子量与分子量分布: 照分子排阻色谱法(中国药典2005年版二部附录V H)测定,重均分子量应小于8000,重均分子量小于8000的级分不少于总量的60%。对照品溶液的制备 精密称取欧洲药典低分子量肝素分子量测定用对照品(Mna:3700)适量,用流动相制成每1ml含10mg的溶液。
8、供试品溶液的制备: 取低分子量肝素适量,加流动相稀释成每1ml约含10mg的溶液。色谱条件与系统校正 以亲水性键合硅胶为填充剂[如TSK G2000SXXL(300mm×7.8mm)或相应的可分离15000〜100000分子量蛋白质的色谱柱];以2.84%无水硫酸钠溶液(用稀硫酸调节pH值至5.0)为流动相;流速为每分钟0.5ml;柱温为35℃;紫外检测器和示差折光检测器以先后次序串联连接色谱柱的出口,准确测量两个检测器的延滞时间以使两色谱图对应,检测波长为234nm。取对照品溶液25μl,注入液相色谱仪,记录紫外和示差色谱图,校正保留时间应为示差检测器的时间。由紫外色谱图的总峰面积(∑UV234)和示差色谱图的总峰面积(∑RI)(除去主峰后的盐和溶剂峰)按式(1)计算比值 r:再按式(2)计算f值。由校正因子f按式(3)计算示差色谱图上每个时间点的分子量Mi:r=∑RI/∑UV234 (1)f=Mna/r (2)Mi=f×RIi/UV234i (3)式中 Mna为对照品的数均分子量; RIi和UV234i 分别为示差和紫外色谱图中各相应时间的峰高。以保留时间对分子量用GPC软件做系统校正。测定法 取供试品溶液25μl注入液相色谱仪,记录示差色谱图(保证主峰和溶剂峰能彻底洗脱),按式(4)计算重均分子量:Mw=∑(RIiMi)/∑RIi式中 RIi 为洗脱的i级分的物质量,即示差色谱图的峰高; Mi 由校正系统得出的i级分的分子量。
9、干燥失重: 取低分子量肝素,以五氧化二磷为干燥剂,60℃减压干燥3小时(压力不超过670Pa),减失重量不得过10.0% (中国药典2005年版二部附录Ⅷ L)。
10、重金属: 取低分子量肝素,依法检查(中国药典2005年版二部附录Ⅷ H 第二法),含重金属不得过百万分之二十。细菌内毒素 取本品,依法检査(中国药典2005年版二部附录Ⅺ E),每1IU中含内毒素的量应小于0.01EU。【效价测定】取本品,照抗Xa因子效价测定法(附一)测定。【类别】抗凝血药。【贮藏】密封,在凉暗处保存。