共聚焦的原理早在1957年就由美国科学家马文·明斯基注册为专利，但实际上经过三十年的时间及相应专用激光器的发展，直至1980年代末这项技术才成为标准技术。1978年，托马斯和克里斯托弗·克莱默设计出一套激光扫描程序。该程序采用激光聚焦的方式逐点扫描物体三维表面，并通过类似于扫描电镜的计算机化手段生成图像。这一共聚焦激光扫描显微设计首次结合了激光扫描方法和荧光标记的生物样品三维探测。接下来的数十年内，共聚焦荧光显微发展成一项成熟的技术，尤其受益于阿姆斯特丹大学（University of Amsterdam），来自海德堡的欧洲分子生物实验室（European Molecular Biology Laboratory）及其业界伙伴的共同努力。
共聚焦显微镜提供了完整，厚实，活体标本的直接，无创，连续光学切片的能力，最小化样品制备以及横向分辨率的微小改善。生物样品通常用荧光染料处理，以使选定的物体可见。然而，实际的染料浓度可以很低，以最小化生物系统的干扰：一些仪器可以跟踪单个荧光分子。此外，转基因技术可以产生生成其自身荧光嵌合分子的生物（例如GFP，绿色荧光蛋白的融合体）用感兴趣的蛋白质）。共聚焦显微镜的工作原理是样品中的点激发（衍射极限点）和所得荧光信号的点检测。探测器上的针孔提供了阻挡离焦荧光的物理屏障。仅记录通风盘的对焦或中心点。