关于外泌体保存的常见问题的解答

希尔博士在接受外泌体NTA检测的技术咨询时，经常会被问到外泌体保存相关的问题。

譬如：

→我的外泌体已经在4度放了一周，还能做检测吗？

→我是1个月前提取的外泌体，一直放在-80度冰箱，还能做粒径检测吗？

→我的样本放在-80度冰箱两个月了，还能提取外泌体做检测吗？

→我在沈阳，寄样本去上海做检测，可以用冰袋寄送吗？

诸如此类………

目前并没有定论来回答以上问题，

我们应该去文献中寻找可参考的信息，

抑或——最科学的方式——自行做对照实验去探究。

Example 1

数据来源：Influence of Storage Condition on Exosome Recovery , DOI: 10.1007/s12257-015-0781-x 

实验目的：探究不同温度下长时间保存对外泌体样本的影响

实验方法：对HEK 293的细胞培养上清提取分离外泌体，将外泌体样本分成4组，分别保存在-70℃、-20℃、4℃和室温下10天后，进行Western Blot检测，选择的marker为HSP70、CD63、CD9。

实验结果：结果显示，在-20℃和-70℃下保存的外泌体比较完整无损，而4℃和室温下CD63已基本没有表达，室温保存条件下HSP70的表达量也有所降低。

相较于4℃、-70℃和新鲜样本，室温存放的外泌体蛋白和RNA浓度的降低程度较明显。

本例说明，-20℃或更低温度是比较可取的外泌体长期存储条件。

Example 2

数据来源：Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses ，DOI: 10.1080/20013078.2017.1359478

实验目的：探究不同温度下保存对外泌体样本的影响

实验方法：提取分离小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的外泌体，将外泌体样本分为三组——新鲜提取组和分别保存在-80℃、4℃ 4天的两组，通过DLS、TEM和zeta电位观察外泌体的变化。

实验结果：结果显示，相较于新鲜提取的外泌体样本，低温储存4天的样本粒径有一定程度的增大，电位数值降低，颗粒有团聚倾向；从TEM图片看，-80℃保存的外泌体有多层结构产生。

另外，该实验也通过无标记的LC-MS/MS评估了外泌体蛋白质含量，结果表明低温储存一定时间都会引发蛋白质泄露。所以，不论是从外泌体结构还是蛋白质含量角度出发，最好是在分离后立即进行各项实验。

Example 3

数据来源：Handling and storage of human body fluids for analysis of extracellular vesicles, DOI: 10.3402/jev.v4.29260

实验目的：探究单次冻融和不同时间、温度储存对血浆EVs的影响

实验方法：血浆在新鲜状态和分别在-20℃、-80℃、-196℃储存6个月和1年后被检测，通过RPS、NTA和FCM观察粒径和浓度的变化。

实验结果：图a-d的RPS和NTA结果说明不同温度下储存6个月和1年对样本浓度和粒径影响不明显，CD235a和CD61的表达量也没有太大差异，只有lactadherin的表达相对于新鲜样本升高了约7倍（图e）。综上说明，该研究中用到的血浆样本在不同温度下（低温）储存，即便长达1年，也能保持一定的稳定性。

同篇文章对唾液和尿液样本也做了类似研究，得到相近结果。

白色：新鲜血浆；灰色：血浆冻存6个月；黑色：血浆冻存1年

也有研究团队对不同储存条件对外泌体中miRNA稳定性做评估：miRNA in Plasma Exosome is Stable under Different Storage Conditions (doi:10.3390/molecules19021568)。

从这几个例子来看，不同时间、温度的保存对不同的外泌体样本影响不一；如果研究方向为外泌体形态特征、蛋白或其他功能性分析，在分离后新鲜使用为最佳。目前主流的建议是提取出外泌体后最好是新鲜使用，或低温短期保存。

而到底低温保存一定时间后是否对外泌体有什么影响，希尔博士认为还是因样本而异，实在纠结的话，还是做对比实验，用实际数据说话！