关于多光子激发成像技术特点的概述

　　Periasamy 和 Skoglund 等比较了相同光学配置下，双光子激光扫描显微镜和共聚焦扫描显微镜 [4]对非洲蟾蜍囊胚以及神经轴胚体细胞的成像能力。 研究结果表明，双光子激发成像穿透深度大、受细胞的固有荧光影响小。 因而 ，双光子提供了研究细胞内动力学、物质空间分布及结构的最佳方法。与荧光显微镜、共聚焦显微镜相比，多光子激光扫描显微镜具有以下特点：

　　(1)对生物样品的光损伤小。克服了共聚焦显微镜在活体细胞和组织观测中的主要缺陷，减少了焦点外的光学伤害和背景光强度，极大地降低了紫外光对生物体正常生理活动的破坏和影响，为活体观测和研究提供了有利条件。

　　(2)有效观测时间长。 荧光染料的光致漂白(即染料分子会因激发次数过多结构受到破坏而失效)是制约实验观测、影响实验结果准确性的主要因素之一。对于共聚焦显微镜，由于整个激光照射区域内的染料分子都会被激发 ,导致非焦点区域的染料过早漂白。 而双光子激发只产生在焦点附近的一个极小区域中，从而大大减少了对非观测区荧光染料的破坏 ，使实验能够在保持生物体活性的前提下长时间进行。

　　(3)穿透深度深。生物体 (细胞、组织等)一般都是高散射体。 由于散射系数反比于入射光波长的四次方，多 (N )光子成像将散射系数减弱到原来的 1 /N4，使大部分入射光强能到达样品焦平面 ，提高了穿透深度，有利于获取深层次组织的清晰荧光图像。

　　(4)荧光收集率高。 与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器 (针孔 ) ，提高了荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。 而共聚焦显微镜受到小孔限制 ，如果想提高收集效率，就需要扩大孔宽度，而这将导致分辨率下降，反之亦然。

　　(5)对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比共聚焦显微镜低得多，光学系统相对简单。

　　(6)适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔，这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的不同信息，便于相互对照、补充。 例如， EGFP和 DsRed 的单光子激发波长分别为 488 nm和 568 nm，无法实现利用一束单波长激光同时激发。 Jakobs等利用双光子技术，用 925 nm激光同时激发了两种荧光蛋白，观察了它们在Escherichia coli 内的表达情况。