关于目的基因组DNA片段的制备的介绍

　　按照常规方法从作为供体的生物细胞中分离纯化其染色体DNA，在一般条件下，由于分离纯化操作中的物理剪切作用，制备出的染色体DNA片段平均大小在10～-200kb左右。然后将染色体DNA用下列方法切成片段，以便与载体分子进行体外重组 [1]。

　　(1)机械切割。供体染色体DNA可用机械方法(如超声波处理等)随机切割成双链平头片段，采取合适的超声波处理强度和时间可将切割的DNA片段控制在一定范围内，其上限为载体的最大装载量，而下限应大于目的基因的长度，否则无法在一个重组克隆中获得完整的目的基因。一胺来说，原核生物的基因长度大都在2kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达1001kb以上，因而将外源DNA片段处理成略小于载体装载量上限的长度始终是正确的，因为每个重组克降中所含的外源DNA片段越大，后续选的规模就越小。当染色体DNA上目的基因区域的限制性酶切图谱未知时，机被切割是制备待克隆DNA片段的首选方法，但由于这些DNA片段具有随机平头末端，因此必须插入载体DNA的平头限制性酶切位点上，而且克隆的外源DNA片段很难完整地从重组分子上卸下。

　　(2)限制性内切酶部分解。采用识别序列为四破基对的限制性内切酶(如MbolSaa3A、Alal等)部分降解染色体DNA，也可获得大片段的DNA分子。由于这些限制性内切酶的识别顺序在任何生物基因组中频繁出现，因此只要采取合适的部分酶解条件同样可以获得一定长度的DNA随机片段，而且经部分酶解获得的DNA片段具有黏性末端，可以直接与载体分子拼接。

　　(3)特定限制性内切酶全酶解。如果染色体DNA中目的基因的两侧拥有已知的限制性内切酶识别位点，而且两者之间距离不超过载体装载量的上限，那么用这一种(或两种)限制性内切酶全酶解染色体DNA片段可能更为有利，所产生的DNA片段呈非随机性，在某些程度上可以简化后续的重组和筛选操作。同时，重组分子可用相同的限制性内切酶完全切下插入片段，这使得利用限制性酶切图谱法直接筛选目的重组子成为可能。