发布时间:2024-08-20 10:35 原文链接: 关于A群脑膜炎球菌多糖菌苗的制造介绍

  一、A群脑膜炎球菌多糖菌苗的菌种

  将生产用种子批菌种启开后,接种在10%羊血琼脂或其他适宜培养基上,放35~37℃二氧化碳环境培养一般不超过18小时,第2~4代菌种可用适宜的固体或液体培养基,35~37℃固体培养基培养不超过18小时,液体培养基培养不超过12小时。菌种自启开后最多不能超过5代。

  二、A群脑膜炎球菌多糖菌苗的培养基

  生产多糖菌苗可选用适宜培养基。生产用的液体培养基不应含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏物质。

  三、A群脑膜炎球菌多糖菌苗的培养

  采用培养罐液体培养,在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验,涂片做革兰氏染色镜检,如发现污染杂菌,应废弃。培养物于对数生长期后或静止期前期收获。一般培养6~8小时(随菌种接种量及使用培养基种类的不同而异)为宜。

  四、A群脑膜炎球菌多糖菌苗的杀菌

  培养物加入甲醛溶液杀菌,或加热56℃10分钟,以确保杀菌完全及不损伤流脑多糖为宜。

  五、A群脑膜炎球菌多糖菌苗的去核酸

  杀菌完成后,离心去菌体收集上清液,于其中加入十六烷基三甲溴化铵,充分混匀形成沉淀。放置适当时间离心,收集沉淀物。沉淀物中加入氯化钙溶液,使其最终浓度为1mol/L,摇动或搅拌1小时,使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离,加入乙醇至最终浓度为25%(ml/ml)。冷库静置1~3小时或过夜,离心去沉淀,收集澄清的上清液。

  六、A群脑膜炎球菌多糖菌苗— 沉淀多糖

  于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%(ml /ml),充分振摇。使多糖沉淀,离心收集沉淀多糖,然后用无水乙醇及两酮各洗二次以上,将沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待进一步提取。

  七、A群脑膜炎球菌多糖菌苗—多糖的精制

  将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中,使其浓度达10~20mg/ml,然后按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml1∶10饱和醋酸钠溶液)提取2~3次,提取时充分振摇。然后离心收集上清液,并用0.1mol/L氯化钙溶液或适宜的溶液透析。必要或有条件时也可用其他方法去除内毒素活性。再加乙醇至最终浓度为75%~80%(ml /ml)。离心收集沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗二次以上。离心后倾去上清液,用无热原蒸馏水溶解沉淀的多糖,所得溶液即为提取之多糖,经除菌过滤后,取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取过程应尽量在15℃以下进行。提纯多糖应保存在-20℃或以下。