ACTH兴奋试验的试验有多种试验方法，如：一次肌注法，连续48h静注法，二日静滴法，五日静滴法。常用后二种方法，肾上腺皮质功能亢进性疾病可用二日静滴法，功能减退性疾病可用五日静滴法。
ACTH兴奋试验的试验的二日静滴法：
1、试验前1、2日留24h尿测定17-OHS、17-KS，或抽静脉血测皮质醇、测外周血嗜酸性粒细胞计数作为对照，可根据当地实验室条件选择。
2、试验日8：00排空膀胱，然后静脉滴注ACTH，25u，溶于5%葡萄糖500ml-1000ml中，控制速度，于8h滴完，连续2日。
3、收集24h(小时)尿测17-OHS、17-KS，或于滴注完抽血测皮质醇，嗜酸性粒细胞。
ACTH兴奋试验的试验的五日静滴法： 试验前准备工作、试验方法，测定指标同二日法，唯时间延长到5日。 正常人ACTH兴奋第1日尿17-OHS、17-KS排泄量比对照日升高1、2倍；第2日比对照日升高2、3倍，第3日比对照日升高3、4倍。血皮质醇较对照日升高2倍-4倍，嗜酸性粒细胞下降50%-80%。
ACTH兴奋后上述参数较基础值有变化为阳性反应。
对肾上腺皮质功能亢进可鉴别良恶性，对功能减退者可鉴别原发或继发性，对女性男性化可鉴别病变部位在肾上腺还是性腺。