农杆菌介导的遗传转化程序

实验概要

农杆菌侵染实验

实验步骤

(1) 农杆菌菌液的制备  

将农杆菌接种于附加50mg/L Km、50mg/L Sm、50mg/L Rif的YEB固体培养基上，28℃暗培养，至长出单菌落。用接菌环挑取单菌落，接种在5mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，于28℃，200r/min 培养过夜。待菌液长至OD600为0.4 ~ 0.6时，将其按1∶10的比例接种到新鲜的上述培养基中振荡培养，进行二次活化。当OD600为0.5 ~ 0.6 时，吸取菌液于无菌离心管中，2000 r/min离心10min，去上清，用等体积的YEB液体培养基重悬，备用。

(2) 侵染 

取继代8天的愈伤组织，置于无菌三角瓶内，加入适量重悬好的菌液，浸泡15~20 min，此间要不时的摇动。浸泡完后，弃菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液。

(3) 共培养 

侵染过的愈伤组织接种于共培养培养基（含有100mg/L阿魏酸的继代培养基）上，28℃暗培养3~5d，以肉眼可见菌落为准。

(4) 除菌 

取共培养后的愈伤组织，放于无菌三角瓶内，先用无菌水冲洗至溶液澄清为止，然后转入液体继代培养基 100mg/L Ac，120r/m震荡培养过夜，其间每隔2～3小时换一次液，再冲洗2~3次后转到附加100mg/L Ac的固体继代培养基上。

(5) 筛选  

将除菌一周后的植物材料转至分化筛选培养基MS 2mg/L 6-BA 30g/L Suc. 100mg/L Ac 0.7mg/L Bia中进行转化筛选及除菌，同时诱导再生植株，两周继代一次。