农杆菌感受态细胞制备实验

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl₂处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl₂溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

土壤农杆菌LBA4404菌株

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1.  挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振荡培养过夜。

2.  取过夜培养菌液1 ml接种于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5。

3.  取2 ml菌液，13 000 rpm，离心30 sec，弃上清。

4、加入1000 ul 20 mM CaCl₂，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30 min。

5、13 000 rpm，离心30 sec，弃上清，置于冰上，加入500 ul预冷的20 mM CaCl₂，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24 hr内使用，或液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用。