农杆菌的转化

实验概要

本实验介绍了农杆菌感受态细胞的制备及转化方法。

主要试剂

YEP固体培养基，含有相应抗生素的YEP培养基，0.15mM NaCl，20mM CaC1₂，液氮，选择平板(Rif 100ug/mL加Gm 50ug/mL加Kan 50ug/mL )

主要设备

培养箱，摇床，离心机，-80℃冰箱

实验步骤

1. 感受态细胞制备

   1) 将农杆菌在含有相应抗生素的YEP固体培养基上划线，30℃培养2-3天，出现菌落。

   2) 挑取单菌落置于5mL含有相应抗生素的YEP培养基中，220rpm，30℃培养过夜。

   3) 取过夜培养的菌液2mL，转接在100mL含有相应抗生素的YEP培养基中，220rpm，30℃继续培养至O.D600=0.5。

   4) 将菌液冰浴30min，然后在4℃条件下500rpm离心5min，弃去上清。

   5) 将菌体重悬于l0mL 0.15mM NaCl中，4℃条件下500rpm离心5min，弃去上清。

   6) 将菌体重悬于1 mL 20mM CaC1₂中，分装成0.2mL的小份在液氮中速冻之后保存于-80℃冰箱或立即使用。

2. 转化

   1) 加质粒(0.1-0.5ug)于融化的感受态细胞中，混匀，冰上放置25 min。

   2) 液氮速冻60 s，37℃放置3 min。加100uL液体YEP培养基，28℃复苏培养3h。涂于选择平板(Rif 100ug/mL加Gm 50ug/mL加Kan 50ug/mL )，28℃培养2至3天。