冰冻切片的原位杂交实验

冰冻切片

Tris·Cl EDTA 甘氨酸 PBS SSC 乙醇 甲酰胺 硫酸葡聚糖 DTT NaCl

加湿盒 水浴锅 培养箱

1.  从冰箱中取出载玻片，平衡至室温，再打开玻片盒。置载玻片于架中，浸泡于以50 mmol/l Tris·Cl（pH7.5）/5 mmol/l EDTA所配的链霉蛋白酶液中，放10 min。
 

2.  室温下将载玻片浸于含2 mg/ml 甘氨酸的PBS中30 s，然后再于PBS中浸2次，毎次30 s。

3.  浸载玻片于新配的TEA缓沖液中5 min。

4.  在一个烧杯中，配足量TEA缓冲液以没过载玻片。加乙酸肝至终浓度0.25%，迅速倒在载玻片上，晃动玻片架使液体充分混合，放置10 min。

5.  在2×SSC中洗载玻片2次，每次5 min。

6.  按顺序经30%、60%、80%、95%和100%乙醇依次缦泡脱水，每次浸2 min，干燥切片并马上用于杂交。

7.  沉淀标记的DNA或RNA探针。确定标记掺入的百分率（比活）并估计合成的探针量，并按最终每千碱基0.2 μg/ml 的浓度，估算杂交混合液的终体积，依此重悬探针沉淀。

8.  首先以2份杂交混合液B及2份去离子的甲酰胺重悬探针沉淀，随后加1份50%硫酸葡聚糖，充分混合。

9.  标记的DNA探针煮沸2 min，马上置于冰浴；或于80℃加热标记的RNA探针30 s，维持于50℃。热变性后，加3.3 mol/l DTT至50 mmol/l 终浓度。用加样吸头，加足量探针充分覆盖切片。

10.  玻片放入密封闭良好的加湿盒中温育4 h，加湿盒中加有加湿盒液B。探针于37 ℃温育探针于42℃温育。

11.  对DNA探针：以预热至37℃的DNA洗液洗2 h，其间换洗液4~5次。

12.  对RNA探针：

（1）在预热至50℃的RNA洗液1中洗15 min，至少洗2次。

（2）玻片在37℃的含20 μg/ml 经煮沸处理RNA酶A的0.5 mol/l NaCl / 10 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）液中温育15 min。

（3）在预热至50℃的RNA洗液1中冼15 min至少洗2次。

（4）在预热至50℃的RNA冼液2中冼15 min，换液2次，（如需要的话，洗片温度可髙至60℃，不过对形态学结果可能有影响）。

13.  在以下各溶液中依次浸泡脱水，每次浸泡2 min：含0.6 mol/l NaCl 的30%乙醇、含0.6 mol/l NaCl 的60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

14.  于空气中干燥切片后，经放射自显影检测杂交的探针。