冷冻干燥和液氮保藏菌种技术

实验概要

掌握冷冻干燥和液氮保藏菌种的技术。

实验步骤

建议用下列方法恢复培养冷冻干燥保藏的菌种：

1. 安瓶管开封

　(1). 用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管。

　(2). 用火焰将安瓿管顶端加热。

　(3). 滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂。

　(4). 用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。

2. 菌株恢复培养

(1). 用无菌吸管，吸取0.3～0.5ml适宜的液体培养基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。

(2). 取0.1～0.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面／平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。

(3). 若未能活化，或活化后有疑问时，请于收到菌种1个月内，通知保藏中心，经查证无误后，即免费补寄。

3. 注意事项

(1). 菌种活化前，请将安瓿管保存在6-10℃的环境下。

(2). 厌氧菌的培养，如无特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态。

(3). 某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长，此时请将步骤2(2)重复一次。

液氮超低温保藏程序：

1. 容器的选择：使用带螺旋盖的2ml塑料安培瓶。

2. 检查安培瓶是否渗漏：用0.05%的亚甲基蓝水溶液在4℃浸泡30-45分钟，冲洗干净，弃去含有蓝色染料的安培瓶，其余的安培瓶备用。

3. 打印标签（激光打印）。

4. 容器的灭菌：先用蒸馏水漂洗干净安培瓶，再用蒸馏水在灭菌锅中121℃浸泡灭菌15分钟，干燥并将打印好的标签放入安培瓶中，略拧紧螺旋盖，再行121℃灭菌30分钟。

5. 保藏菌菌龄：处于最大生长量阶段或对数生长期后期。

6. 保护剂：选用5-10%的甘油或二甲基亚砜作保护剂。

(1). 甘油的准备：在121℃灭菌15分钟，2-8℃贮存。甘油一般以两倍最终所需浓度的水溶液保存，然后与同等量的细胞悬液混合。若不用细胞悬液，则以最终所需浓度的水溶液保存。

(2). 二甲基亚砜：用0.22μm的聚四氟乙烯过滤膜过滤除菌。过滤膜预先用甲醇和二甲基亚砜漂洗。无菌的二甲基亚砜以10-15ml装量2-8℃避光保存。

7. 分装：在无菌条件下，将细胞悬液（从平板上打下直径为125px的菌块）分装于安培瓶中，并注入保护剂，拧紧螺旋盖。

8. 将安培瓶固定在铝夹上，贴好标签。为了便于取用，一般一个铝夹上仅放一个菌株。

9. 将控温系统先预冷到4℃，再将铝夹放入其中。以每分钟1℃降温至-40℃，然后以每分钟10℃降温至-90℃。降温以后，将铝夹转移至处于液氮中的储存器中保存。

10. 菌种的复活：将液氮保藏的菌种取出，迅速放入37℃水浴中解冻。一般需2至2.5分钟，等完全解冻后，再及时转接到合适的培养基中培养。