冷冻电镜是如何观测到原子级别的生命结构的

冰是一种大家再熟悉不过的物质了。在一个大气压下，当水的温度低于零度时，便会变成固态的冰。水分子在彼此之间的极性相互作用力(范德瓦尔斯力)之下，形成规则的排列形式，变成晶体状态。这是我们生活中常见的冰的存在方式。冰晶的内部通常是极为纯净的，只有水分子存在，任何其他杂质都会在结晶的过程中被挤出晶体之外。当有较多其他杂质存在的情况下，通常会形成多晶。水结冰后体积还会发生膨胀，造成晶体之间相互挤压。生物体内的水如果结冰，冰的膨胀效应和相互挤压会对细胞或组织的结构造成破坏。如果要将生物体冷冻起来，就必须避免冰晶的形成。这也是难以通过冷冻的方法来长期保存生命体的主要原因。

在 20 世纪 30 年代，人们就已经知道水可以形成非晶的状态。也就是说，在低温下水虽然被冻结了，但是水分子并没有形成晶体的规则排列，还是无序的，称之为玻璃态。玻璃态的冰和水的密度相同，没有膨胀效应，也可以和其他的物质共存。因而不会对与其共存的物质造成排斥和挤压并破坏共存物的结构。'

这种玻璃态冰的形成需要非常快的冷却速度，达到每秒几十万度。可以认为冷却的速度必须足够快，以至于水分子没有时间移动形成规则排列的晶体，在一瞬间被冻在了原地，因此也就不会对原有的结构造成破坏。但是如何获得这么快的冷却速度形成玻璃态冰，在很长时间内一直都没有很好的办法。

在玻璃态冰能够被成功制备出来之前，人们都是采用负染色技术来固定生物结构并对其观察的。负染技术使用重金属盐作为染色剂，比如甲酸铀或者醋酸双氧铀。首先让重金属盐覆盖并渗透到生物大分子中去，然后把样品晾干脱水，蛋白质在这个干燥的过程中可能已经分解或者破坏掉了，但干燥后的盐保持了生物大分子在干燥前的外部轮廓。这个过程有点像铸造时制作沙模的过程，重金属盐就是沙子。当用电镜观察时，人们看到的生物大分子的图像其实是蛋白降解后留下的空洞，因此衬度是反转的，所以称为负染(图2)。负染的优势是操作简单，图像衬度高。缺点是无法获得高分辨率，因为观察到的仅是重金属盐而已经不是蛋白本身了。相应地，负染分辨率的上限只能达到十几埃左右。最早的生物样品的高分辨率结构都是通过负染技术来观察的，比如20世纪50年代人们就借助负染技术看到了与老年痴呆相关的脑神经细胞中出现的淀粉样沉淀，以及多种植物病毒的影像。虽然负染的分辨率远达不到原子水平，但是其相对于光学显微镜来说分辨率已经很高了。所以，这一技术目前依然有着很广泛的应用，用于对样品质量的快速检测和样品结构的初步分析，是最主要的日常电镜生物结构分析手段之一。随着高压冷冻和冷冻替代技术的发展，负染色技术也是目前观察细胞或者组织样品的重要手段。