| 实验方法原理 | 剪碎的组织放在胰蛋白酶中于4°C 放置16~18h ，去除胰蛋白酶后温育并于温培养基中分散细胞。 |
|---|---|
| 实验材料 | 组织 DBSS 粗制胰蛋白酶 |
| 试剂、试剂盒 | 生长培养基 皮氏平皿 |
| 仪器、耗材 | 培养瓶 镊子 移液管 锥形瓶 剪刀 冰浴 |
| 实验步骤 | 1. 将组织（1~5 g，预先称重）移入加有新配制的无菌 DBSS 的皮氏培养皿中，清洗。 2. 转入另一培养皿中，切除多余组织如脂肪和坏死组织。 3. 转入第三个培养皿中，用交叉的手术刀细切成大约 3 mm3 的小块。胚胎的器官若小于 3 mm3 ，可全部保留。 4. 用弯镊子将组织块移入一个预称重的 15 ml 或 50 ml 无菌离心管内。 5. 让组织块沉降。 6. 用 DBSS 重悬清洗组织块，沉降后去除上清，重复此步骤两次以上。 7. 小心去除剩余液体，预先称重。 8. 每克组织加入 10 ml 溶于 RPMI1640 或 S-MEM 的 0.25 % 胰蛋白酶（0.25 粗制胰蛋白酶溶于无血清的 RPMI1640或 MEM/Stirrer salt (S~MEM ) 中），置于 4°C 。 9. 4°C 放置 6~18 h 。 10. 小心吸去胰蛋白酶，余下组织及残余胰蛋白酶（若需要，此时可加人 1~2 ml 其他酶，如胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶等）。 11. 37°C 放置 20~30 min 。 12. 加入温培养基，大约每 100 mg 初始的组织加 1 ml，轻轻上下吸打混合物至组织完全分散开。 13. 若部分组织未分散，细胞悬液可用无菌的平纹纱布或不锈钢筛（100~200 μm )，或一次性使用的塑料筛滤网过滤细胞，或者让大的组织块沉降。当有较多组织时，可于每克组织中多加入 20 ml 培养基促进沉淀和随后的悬液收集，通常 2~3 min 就足以去除大多数的大块组织。 14. 用血球计数板或电子计数仪测定悬液的细胞密度，检査活细胞比率。 15. 细胞群体为异源性，由于校准口径较困难，因而初次使用电子计数仪时，需要用血球计数板来确认。 16. 将细胞悬液生长培养基（生长培养基（如DMEM/F12，含10% 胎牛血清））稀释，使每毫升培养基含有 1×106 个细胞。按照需求接种于多个培养瓶（25 cm2、75cm2 培养瓶）中，大约每平方厘米为 2×105 个细胞。当存活率不明确或难以预知时，细胞计数便无价值（如肿瘤活检时，死亡细胞的比例很高）。在这种情况下，建议按每毫升 5~25 mg 组织的浓度接种。 17. 间隔一定时间更换一次培养基（2~4 天，以 pH 下降为标准）。由于部分细胞黏附较慢甚至易于悬浮生长，所以丢弃上清前要先检査上清液中是否有存活的细胞。  |
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