凝胶层析法分离蛋白质操作方法

　　本实验通过SephadexG50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同可观察到血红蛋白洗脱快，硫酸铜洗脱较慢。

　　三．材料

　　1．仪器 层析柱(直径0.8-1.5cm，长10-20cm)；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量筒；试管。

　　2．试剂 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸铜溶液

　　四．方法

　　（一）凝胶的准备。由准备室制备。

　　（二）样品制备

　　1．血红蛋白(Hb)溶液的制备 取抗凝血液约0.5ml于离心管中，离心5分钟(2500rpm)，弃去上层血浆，用0.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次，将血细胞用1.5ml蒸馏水稀释，即为Hb稀释液，备用。

　　3．取Hb稀释液与CuSO4溶液各0.5ml，充分混匀，此混合液作为样品。

　　（三）装柱 取层析柱(直径0.8-1.5cm，长度20cm)一支，将层析柱烧结板下端的死区用蒸馏水充满，不得留有气泡，然后关闭层析柱的出口。将已溶胀的凝胶悬液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶层积集至约15cm高度即可。凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。

　　（四）加样与洗脱：加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待床面上只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口。用滴管将样品(约0.4ml)小心地加到凝胶床的表面上。注意加样时不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入。然后，打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)，用上法滴加1-2倍样品体积的蒸馏水，待完全流进床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直至两条区带分开为止。

　　注意事项：洗脱的过程中，应不断滴加蒸馏水，使始终凝胶床的上表面保留约2cm左右的蒸馏水