几种典型扫描电镜生物样本制备

隨着科学技术的发展，扫描电子显微镜技术已成为检测物质性能和表征微观结构的重要手段，被广泛应用于食品学、生物学、医学、高分子材料等领域[1]。扫描电子显微镜在科学研究中有广泛应用，如观察不同淀粉颗粒的超微形貌[2]、蛋白复合膜的微观结构[3]、淀粉纳米颗粒的研究[4]及不同储藏过程中肉食类微结构的变化[5]等。相较于传统的光学显微镜和透射电镜，扫描电镜具有以下特点：直接多角度观察样品的表面结构；不需要将样品切成薄片；景深大、图像立体感强；放大倍数从几十倍到几十万倍连续可调；电子束能量较低，对样品的损伤小；在观察形貌的同时可以对微区的成分进行定量和定性分析。
　　扫描电镜同样对于样品有一定的要求，需要满足以下条件：①导电性能好，样品在电子束的作用下表面电位不会升高，不会产生荷电效应[6]；②样品要尽可能干燥，电子束在真空状态下运行，若样品中含有水分，水分挥发会造成图像漂移，损伤光阑和灯丝等[7]；③热稳定性好，避免在电子束作用下样品分解，释放出气体或其他物质，污染镜筒；④样品不能有磁性。粉末样品尤其是超微粒子，吉普斯自由能较大[8]，在样品制备过程中需克服团聚现象，且使样品有一定的密度[9]。生物样品具有含水量高、导电性差等特点。生物样品的含水量一般为70%～80%，只有少数的样品，如花粉、毛发等可以直接放入扫描电镜中观察，大部分生物样品需要经过脱水干燥处理后才能进行观察[10]。因此生物样品制备的关键步骤是干燥，应尽量减少因水分蒸发导致的形变。因此扫描电镜的样品制备方法对于电镜的观察非常重要[11]，能否获得真实、清晰、理想的扫描电镜图片，样品制备方法非常关键。
　　本试验研究了12种典型样品（包括普通粉末材料、纳米材料、微生物、植物和动物）的扫描电镜制备方法，对扫描电镜样品制备方法进行全面阐述，同时对其他方法进行了改进，为同类样品的扫描电镜样品制备提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 粉末样品 淀粉颗粒，淀粉纳米颗粒。
　　1.1.2 生物样品 金黄色葡萄球菌（球菌）、大肠杆菌（杆菌）、放线菌（真菌）、青岛老鹳草（陆生植物）的花粉、睡莲（水生植物）的花粉、绞股蓝的叶片、玉米茎秆、青岛百合的花芽、鸡血和鸡气管等。
　　1.1.3 主要仪器 JFC-1600型离子溅射仪、JFD-320型冷冻干燥机、Emitech K850型二氧化碳临界点干燥仪、JSM-7500F场发射扫描电子显微镜。
　　1.1.4 所用试剂 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）、2.5%戊二醛溶液、1%四氧化锇溶液、FAA固定液、乙醇、丙酮、醋酸异戊酯、叔丁醇等。所有试剂均为分析纯，试验用水均为去离子水。
　　1.2 方法
　　1.2.1 牙签直接固定法 将双面导电胶带粘到样品台上，用牙签蘸取待测样品，轻轻用手指将牙签上多余的样品弹掉。然后将牙签轻轻在双面胶上滚动，使样品颗粒均匀地涂布到导电胶上。用洗耳球轻吹试样，除去未附着的或者没有固定牢固的颗粒。
　　1.2.2 铜片固定法 取少量样品置于离心管中，加入适量的乙醇，将剪成0.5 cm×0.5 cm大小清洗过的铜片放入离心管中，超声15 min后，用镊子将铜片取出，然后将附着有样品的铜片放在滤纸上，自然干燥，用导电胶水将铜片固定在样品台上。
　　1.2.3 铜网碳载膜捞取法 取少量样品置于离心管中，加入合适的分散剂（常用的分散剂有乙醇、丙酮、水或者0.1% SDS水溶液，分散剂的选择标准：①样品不能溶解在该试剂中；②易挥发，超声15 min后，用镊子取一片附有碳膜的铜网，轻轻捞取样品，立即放在铜网盒中置于-20 ℃冰箱中预冷20 min，放入冷冻干燥机中干燥样品3 h左右，样品完全干燥后取出铜网，用导电胶水将铜网粘到样品台上。
　　以上3种方法制备完成后，导电类粉末可以直接进行扫描电镜观察，不导电的粉末样品需喷金导电处理后进行观察。
　　以上样品的具体处理方法见表1。
　　1.2.4 球菌（金黄色葡萄球菌）和杆菌（大肠杆菌）的扫描电镜样品制备 取培养至稳定期或对数生长后期的菌液2～3 mL，8 000 r/min离心3～5 min，弃上清，加入40倍菌体体积的2.5%戊二醛固定液，置于4 ℃冰箱中固定2 h以上，用磷酸盐缓冲液冲洗2～3遍，依次用50%、70%、90%和100%乙醇进行梯度脱水，每次脱水时间为5～10 min。脱水结束后，用乙醇-叔丁醇溶液（1∶1，V/V，下同）置换20 min，最后用100%叔丁醇置换两次，每次20 min。置换后将样品进行冷冻干燥处理，干燥后的样品进行离子溅射仪喷镀后，扫描电子显微镜观察、拍照。
　　1.2.5 放线菌的扫描电镜样品制备 在固体培养基中培养放线菌，用镊子将灭菌处理的盖玻片以45°夹角插入培养基中，让细菌爬片生长。将盖玻片轻轻拔出，用磷酸缓冲液将盖玻片上多余的培养基洗掉。将盖玻片放到预装有2.5%戊二醛溶液中（有菌丝的一面朝上），室