几种蛋白质浓度测定方法

一、Bradford法

蛋白质与考马斯亮兰染料结合生成蓝色物质，蓝色物质的量与蛋白质浓度的高低成正比。生成的蓝色物质在595nm处有最大光吸收，通过测定595nm的光吸收，来测定蛋白质浓度。实验中一般利用牛血清白蛋白(BSA)来作标准曲线，此法的灵敏度为25~200ug/ml。甘油、吐温（tween）80、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷（Tris）和一些碱性缓冲液会干扰该检测反应，可以通过设立适当的对照来消除这种干扰。

试剂准备：

1．Bradford储存液：95%乙醇，100mL；88%磷酸，200mL；考马斯亮兰G-250染料，350mg；室温下可长期稳定保存。

2．Bradford工作液：双蒸水，425mL；95%乙醇，15mL；88%磷酸，30mL；Bradford储存液，30mL；Whatman I号滤纸过滤，室温保存于棕色瓶中，可用数周，但用前需重新过滤。

3．标准蛋白：1mg/mL牛血清白蛋白。

操作方法：

1．以PBS为空白对照，将标准蛋白BSA梯度稀释为20ug/mL、17.5 ug/mL、15 ug/mL、12.5 ug/mL、10 ug/mL、7.5 ug/mL、5 ug/mL、2.5 ug/mL，待测样品做适当稀释，每管100uL。每次实验应做一新的标准曲线；没个样品2~3个重复管。

2．加入1mL Bradford 工作液，振荡混匀，室温反应2分钟。由于染料和蛋白的反应时连续的，所以染料应依次加入到个蛋白样品中，所有样品也应按照加入染料的顺序测定A595值。

3．测定A595值，测量应在1小时内完成。

4．以标准蛋白的浓度为横坐标，A595值为纵坐标画出标准曲线，根据标准曲线，通过待测样品的A595值，确定其浓度。

二、Lowry法

Lowry法又称Folin-酚法，蛋白在碱性溶液中与相应试剂形成铜-蛋白复合物，这一复合物还原Folin-酚试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂），产生深蓝色的钼蓝和钨蓝复合物，这种深蓝色复合物在745~750nm处有最大光吸收，吸光度与蛋白浓度成正比。

试剂准备：

1．缓冲液A（溶液可长期保存于室温）：CuSO4·5H2O，0.5g；Na3C6H5O7·2H2O，1g；加双蒸水至100mL。

2．缓冲液B（溶液可长期保存于室温）：Na2CO3，20g；NaOH，4g；加双蒸水至1L。

3．缓冲液C：缓冲液A，1ml；缓冲液B，50mL。

4．缓冲液D：Folin-酚试剂，10mL；双蒸水，10mL。

操作方法：

1．以蒸馏水为空白对照，将标准蛋白BSA梯度稀释为500ug/mL、250 ug/mL、125 ug/mL、62.5 ug/mL、31.25 ug/mL，待测样品做适当稀释，每管40uL。标准蛋白的选择对实验结果影响较大，一般应该选择和目的蛋白类似的样品作为标准蛋白比较好，比如测定抗体浓度时，选择同种动物IgG作为阳性对照的结果比BSA结果准确。

2．加缓冲液C 200uL，混匀，室温反应5~10分钟。

3．加缓冲液D 20uL，混匀，室温反应20~30分钟。

4．测定A750值。做标准曲线，根据待测样品的A750值，计算待测蛋白的浓度。

三、紫外吸收法

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外线的性质，在280nm处有最大光吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值可以反映蛋白的浓度。紫外吸收法简便、快速，但准确度较差。对于含核酸的蛋白质溶液，还应测定其A260。

操作方法：

1．准备空白对照和待测蛋白溶液。

2．调节仪器波长为280nm。

3．用空白对照调节吸光度A280为零。通常用1cm光径的标准石英比色皿。

4．读取待测蛋白溶液的A280。

5．调节仪器波长为260nm，用空白对照调节吸光度A260为零，读取待测蛋白溶液的A260。

6．计算蛋白浓度：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×A280-0.74×A260。