出色灵敏度提升复杂基质中目标肽段定量能力（二）

高效液相色谱分离

高效液相色谱仪: Thermo Scientific EASY-nLC 1000

预柱：Dionex PepMap C18 色谱柱（2cm, ID75μm, 3μm）

分析柱：Dionex PepMap C18 色谱柱（15cm, ID75μm, 3μm）

流动相：A，含0.1% 甲酸的水溶液；B，含0.1% 甲酸的乙腈溶液

梯度： 2%-5% B 2 min，2%-45% B 42min，45%-90% B 3 min，90%B 3min

流速：300 nL/min

上样量: 2 μL

质谱分析

质谱仪：Thermo Scientific TSQ Quantiva

离子源：NanoFlex 离子源

离子模式：正离子

喷雾电压：2.0 KV

毛细管温度：275 ℃

Q1 and Q3 resolution: 0.7 Da;

Cycle time：2s

碰撞能量：通过公式CE=0.034 × 母离子的m/z + 5.314 计算得到相应肽段的碰撞能量，并在此基础上CE加减2 进行进一步优化，选择最优碰撞能量。

实验结果

本实验采用全新一代三重四极杆质谱TSQ Quantiva 对复杂基质中15 条重标肽段进行定量分析，均可获得良好的色谱峰形和质谱响应（图3）。以肽段SSAAPPPPPR* 为例，检出限为（LOD）1amol，定量下限（LLOQ）为5amol（图4）。如图5 标准曲线所示，在5amol-100fmol 五个数量级浓度范围内，浓度与峰面积的线性相关系数在0.99 以上，同时，在amol 级水平仍可获得良好重复性（图6）。15 条肽段的标准曲线和线性范围参见表2。

图3. 15 条肽段总离子流图（TIC）（上样量100fmol）

图4. 肽段SSAAPPPPPR* 不同上样量提取离子流图（EIC）m/z493.8-> m/z 335.7

图5. 肽段SSAAPPPPPR* 标准曲线

图6. 肽段SSAAPPPPPR* 在amol 水平重复性

表2. 15 条肽段标曲和线性范围

结论

实验表明，得益于主动离子管控技术（AIM），TSQ Quantiva在复杂基质中针对目标肽段的定量灵敏度表现突出，极大地提升了TSQ 质谱平台定量复杂基质中目标肽段的能力，适用于复杂生物学样本中低丰度蛋白质的分析，可用于潜在生物标志物的确证工作。