尺寸排阻色谱法:是按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法,也称凝胶色谱法.
排阻色谱的固定相多为凝胶.凝胶是一种由有机分子制成的分子筛 , 其表面惰性 , 含有许多不同大小孔穴或立体网状结构.凝胶的孔穴大小与被分离组分大小相当 , 对不同大小的组分分子则可分别渗到凝胶孔内的不同深度.尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内 , 但进不了小孔 , 甚至于完全被排斥,先流出色谱柱.尺寸小的组分分子, 大孔小孔都可以渗进去, 最后流出.因此 , 大的组分分子在色谱柱中停留时间较短, 很快被洗出.小的组分分子在色谱柱中停留时间较长.经过一定时间后, 各组分按分子大小得到分离.
当组分X进入柱子后,它就要从高浓度的流动相向固定相孔隙内的流动相扩散.当组分X进入色谱固定相达到扩散平衡时:
Xm Xn
组分的分配系数为:
尺寸排阻色谱中任何组分的分配系数应符合:0 ≤ K ≤ 1
二. 固定相
尺寸排阻色谱常用固定相有无机和有机两大类.
无机凝胶:又称硬质凝胶.是具有一定孔径范围的多孔性凝胶,如多孔硅胶,多孔玻璃珠等,此类凝胶化学惰性,稳定性及机械强度均好,耐高温,使用寿命长,但装柱时易碎,不易装紧,柱效较低.
有机凝胶:又称半硬质凝胶.如苯乙烯二乙烯苯交联共聚物凝胶,能耐较高压力,适用于有机溶剂作流动相,有一定可压缩性,可填得紧密,柱效较高.但在有机溶剂中有轻度膨胀.新型凝胶色谱填料,克服了传统软填料的一些弱点,粒度细,机械强度高,分离速度快,效果好,特别是无机填料表面键合亲水性单分子层或多层覆盖的单糖或多糖型等填料广泛用于生物大分子的分离.
三. 流动相
尺寸排阻色谱流动相:从样品的溶解性考虑,流动相应与凝胶本身有相似性, 黏度低,与样品的折光率相差大;能润湿凝胶,防止吸附作用.
常用的流动相有四氢呋喃,甲苯,N,N'-二甲基甲酸胺,三氯甲烷(凝胶渗透色谱);水(凝胶过滤色谱)等.
(可用于分离相对分子质量大的分子,如蛋白质,核酸等)
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