分光光度计测定溶液的吸光值

蛋白质纯化实验中，将会测定 b-glucuronidase （GUS） 的活性，是利用 p-nitrophenyl b-D-glucuronide 为基质，加入酵素反应后所释出之 p-nitrophenol 在碱性下呈现黄色，可测定 415 nm 之吸光度，利用 Beers Law 即可计算求得反应物之生成量。 本实验将利用已知浓度之 p-nitrophenol,测定其 A415,以求取 p-nitrophenol 在 GUS 活性测定条件下之 消光系数 （extinction coefficient）。

药品试剂：

p-Nitrophenol10×GUS assay buffer （0.5 M Na phosphate, pH 7.0; 1% Triton X-100; 0.1 Mβ-mercaptoethanol）GUS 终止液 （2.5 M 2-amino 2-methyl propanediol, 溶于水中， pH 11）

方法步骤：

1） 配制5 mM p-nitrophenol stock solution: 秤取 _____ mg p-nitrophenol,置于400 mL 烧杯中，加入25 mL 10×GUS assay buffer,加水至约200 mL,搅拌溶解后，加水至250 mL 并混合均匀。请配制三份。

2） 配制50 μM p-nitrophenol 溶液：分别由三份stock solution 取适量以1×GUSassay buffer 稀释之。

3） 取1 mL 50 μM p-nitrophenol溶液于试管中，加入0.4 mL 2.5 M 2-amino2-methyl propanediol溶液，混合均匀后测定A415. 另取1 mL 1×GUS assaybuffer,加入0.4 mL 2.5 M 2-amino 2-methyl propanediol溶液，混合均匀，亦测定A415,以作为blank.

4） 由Beer's Law 求出p-nitrophenol 在此测定条件下之消光系数。