分离核仁实验

肝脏

NKM

粗孔滤纸 Teflon-玻璃匀浆器

1. 制备溶液：

NKM：0.13 mol/L NaCl，5 mmol/L KCl，8 mmol/L MgCl₂

0.34 mol/L 蔗糖，3 mmol/L MgCl₂

2.3 mol/L 蔗糖，10 mmol/L MgCl₂

0.34 mol/L 蔗糖，0.05 mmol/L MgCl₂

0.88 mol/L 蔗糖

2. （可选）用冰冷的 NKM 溶液灌注肝脏。

3. 称组织重量，用剃刀或剪刀切成非常小的碎块，或者用组织压挤器进行压挤。

4. 每克组织加 10 倍体积的含 0.34 mol/L 蔗糖和 3 mmol/L MgCl₂ 的溶液进行匀浆破碎细胞。

5. 匀浆通过 4 层粗孔滤纸以去除结缔組织。

6. 4℃，500 g 离心 10 分钟。

7. 用紧密结合的 Teflon-玻璃匀浆器匀浆使细胞核粗品重悬浮于 10 倍体枳（每克起始组织）的含 2.3 mol/L 蔗糖，10 mmol/L MgCl₂ 的溶液中。

8. 40000 g 离心 1 小时沉淀细胞核。

9. (可选）温和地将细胞核沉淀重悬浮于 0.5 倍体积的含 0.34 mol/L 蔗糖，0.25% (w/v) Triton X-100 和 5 mmol/L MgCl₂ 的溶液中，500 g 离心 10 分钟得到沉淀。

10. 将细胞核重悬浮于 0.16 倍体积的含 0.34 mol/L 蔗糖和 0.05 mmol/L MgCl₂ 的溶液中。

11. 超声处理细胞核悬液 4 次，每次大约 10 秒钟。

12. 在超声处理过的细胞核下面加一层含 0.88 mol/L 蔗糖和 0.05 mmol/L MgCl₂ 的溶液，2000 g 离心 30 分钟。

13. 收集核仁沉淀。