分离肝脏质膜的Neville法实验

实验材料 切碎的大鼠肝脏

试剂、试剂盒 溶液 A 蔗糖溶液 B

仪器、耗材 Doimce 氏玻璃匀浆器离心管 折射仪SW-28 转头及薄壁 polyallomer(同质异晶聚合物）SW-28 离心管

实验步骤

材料与设备

切碎的大鼠肝脏（约 25 g; 冷冻保存至用前）

注：人的胎盘是极好的制取胰岛素受体的原料。遗憾的是，非医学中心附属机构的研究人员可能很难得到人的胎盘。

Doimce 氏玻璃匀浆器（15-ml), 带有 A、B 杵

粗布（干酪包布）

离心管（250-ml）

折射仪（No.13_947;Fisher Scientific 公司或其他品牌）

SW-28 转头及薄壁 polyallomer(同质异晶聚合物）SW-28 离心管

试剂

溶液 A

蔗糖〔69%(w/w) 和 42.3%(w/w)〕

溶液 B

(配方，见「试剂的配制'PP.234~240)

操作程序

此操作程序据 Neville(1968) 的方法改进而成。全部操作在 4°C 下进行。

1) 取约 68 切碎的鼠肝，置中号（15-ml)Dounce 氏玻璃匀浆器内。加 8 ml 冰冷的溶液 A, 置冰浴用松的 B 杵抽研鼠肝 8 次。缓缓操作不要使匀浆溅出。然后将匀浆倒入 500 ml 溶液 A(置冰浴) 中。重复此操作, 分三批处理其余约 18 g 鼠肝，并将匀浆均倒入上述 500 ml 溶液 A 中。最终的混合物搅拌 3 min 后，用双层粗布过滤，收集于 2000-ml 烧瓶中。

注：制备组织匀浆时，研杵要上下抽研以形成剪切力，旋拧是没什么用的。如果研杵抽拉太困难，可以慢慢取出，再用纸张擦去附于研杵球部的结缔组织缠绕物。不要向下用力冲研没有支撑好的匀浆器，否则会弄破匀浆器。要用手抓牢匀浆器同时将它支撑于冰筒中。要避免在匀浆中产生气泡。

2) 将滤过的匀浆分置于 6 个 250-m 的离心管中，4°C 下 1500 g（JA-14 转头,3200r/min) 离心 10 min。用吸管将上清慢慢吸出，但不要搅动松疏的沉淀物。然后把沉淀移至置于冰浴中的 15-ml Doimce 氏匀浆器中。

3) 用松的 B 杵温和抽研三次，匀浆沉淀物, 测量匀桨体积。

4) 将匀浆倒入烧杯。加等体积 69%(w/w) 的蔗糖溶液，搅拌混合至无可见的絮状物。用折射仪检査溶液的蔗糖浓度。加水或 69% 的蔗糖液调节，使蔗糖-匀浆混合液含有 44% 的蔗糖（折射率为 1.4076)。

注：折射仪测量时，每次读数间隙要充分混匀匀浆。

5) 将匀浆倒人若干 SW-28 离心管，毎管 20 ml。

6) 小心地在每份匀浆顶层加 10 ml 42,3%(w/w) 冰冷的蔗糖液 (折射率为 1.4042)。

7) 用 42.3% 冰冷的蔗糖液平衡离心管。

8) 将离心管放入冷的 SW-28 转头，25000r/min(90000 g) 离心 2 h，检查 0 型圈上的真空脂，确保转头无泄漏。

9) 用刮勺移出浮在离心管顶层上 2?4-mm 厚的膜层，转移至同一个 SW-28 管。加人溶液 B，温和混匀。4°C 下 25000r/min 离心 30 min 收集膜部分，此步可去除蔗糖。弃去上清后，再加 3 ml 溶液 B 于沉淀物。于 Dourtce 氏匀浆器（15-ml) 中用 A 杵温和匀浆沉淀物，悬液等分分装于微型离心管，每份 0.25-ml。-20°C 冻存。