初代细胞培养实验

组织

Hanks 培养液 胰蛋白酶

吸管 平皿 培养瓶 烧杯 搅拌器 三角烧瓶 不锈钢筛 眼科剪 眼科镊 计数板

1.  准备

取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20 分钟；

2.  布局

点燃酒精灯（或煤气灯），安装吸管帽（应通过火焰）；

3.  处理组织

把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60 分钟；

4.  剪切

用眼科剪把组织块切成2~3 毫米大小的块（用手术刀割亦可），以便于消化；加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；

5.  消化

或用恒温水浴，或置入37 ℃温箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好（消化前瓶中需置一无菌搅棒）；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定；

6.  分离

在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块（必要时可继续进行消化）；低速（500~1000 转/分）离心消化液5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再加入培养液）；

7.  计数

用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH 要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说胆液体变酸，可用NaHCO₃调整；

8.  培养

置入36.5 ℃温箱培养；如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。

组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部（工作时宜挽上袖口）。

最常用的初代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂(如EDTA)除去细胞互相粘着所依赖的Ca^2＋，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。

参考《组织培养和分子细胞学技术》北京出版社