利用双压线性离子阱质谱仪多重解离技术对API杂质谱进行全面分析
Theresa Lynch 1 ; Kate Comstock 2 ; Jack Cunniff 2
1 Gilead Sciences, 333 Lakeside Dr, Foster City, CA; 2 Thermo Fisher Scientific,
355 River Oaks Parkway, San Jose, CA
前言
活性药物成分（API）和成品药的杂质分析是药物研发中不可或缺的一环。杂质的化学结构信息在评估毒性、改进合成途径，以及根据目标成药选择最佳剂型至关重要。为保证药效与消费者的安全，世界各国的监管机构都制定了药物杂质分析的指引，清楚说明基于日服用量、使用时间，和药物靶标的限量标准。
LCMS 已经成为最常用的未知杂质分析技术。为了能在大量母药中识别并表征痕量杂质，具有高灵敏度、高扫描速度，并且能进行多级质谱分析（MS n ） 的质谱仪必不可少。在本研究中，Sigma-Aldrich 所售的研究级阿德福韦酯（adefovir dipivoxil，ADP） 被用来作为模型化合物进行 API杂质分析。ADP 是广泛用于慢性乙肝病毒感染的一种抗病毒处方药。本研究中使用的 LCMS 系统由 Thermo ScientificAccela TM UHPLC以及 Velos Pro TM 双压线性离子阱质谱仪构成。碎片信息通过结合应用 CID 与 Trap-HCD 解离技术获得。数据处理通过软件 Mass Frontier TM 完成。
分析方法
材料与试剂
阿德福韦酯（Adefovir dipivoxil，CAS# 142340-99-6）从 Sigma-Aldrich 购得，产品号 A9730。
乙腈和水 （Fisher）；乙酸铵（Sigma-Aldrich，产品号73594-25G-F）；甲酸（Sigma-Aldrich，产品号 33015-
500ml）。
样品制备
ADP溶液，0.5mg/mL，用 1 ml 20 : 80 的乙腈和水混合溶剂溶解 0.5mg ADP 获得。
HPLC方法
HPLC系统：Thermo Accela 1250 泵，开放式 Accela 自动进样器及 Accela PDA
色谱柱： Hypersil GOLD C18 2.1×150 mm，3 µM，
Thermo Scientific 产品号 071399
柱温：35 ℃
流速：0.5 ml/ 分钟
进样体积：8 μl
流动相：A – 水，B – 乙腈，C - 100 mM 乙酸铵，用乙酸调至 pH 5
梯度洗脱：
时间（min） A% B% C%
0 80 10 10
12.0 20 70 10
14.0 20 70 10
14.1 10 80 10
15.0 10 80 10
15.1 80 10 10
19.0 80 10 10
质谱方法
质谱仪：配有 HESI-II 离子源的 Velos Pro TM 双压线性离子阱
离子化条件：电喷雾， 正离子模式
1. 全扫模式 m/z 120-1000 amu/ Top5 dd MS/MS，HCD NCE 35%
2. 全扫模式 / 按母离子列表 dd MS 2 / TOP 3 ddMS 3 ,CID/Trap-HCD NCE 20%
a. CID MS 2 / CID MS 3
b. CID MS 2 / HCD MS 3
c. HCD MS 2 / CID MS 3
d. HCD MS 2 / HCD MS
结果与讨论
I. 全扫—Top5 HCD dd MS/MS 与“FISh”
ADP 杂质谱分析流程由两次连续的 LCMS 实验构成。分析目标是为杂质鉴定和结构解析收集尽可能多的信息。
第一个
MS 实验包括全扫描和后续的 Top5 HCD 数据依赖MS/MS 扫描（图 1）。 接下来，数据通过 Mass Frontier 当中的
Fragment Ion
Search（碎片离子检索，FISh）算法进行处理，这是一个新颖的进行杂质检出及鉴定的方法，主要基于母离子解离模式的比较（图
2a，b）。与母药拥有相同碎片的成分会被“FISh”识别出来，见图 3。
