利用大引物PCR在同一试管中进行高效快速定点诱变实验

扩增缓冲液 含有四种 dNTP 的混合溶液 热稳定 DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 正向和反向内引物 诱变引物 模板 DNA

带屏障装置的自动移液器用吸头 微型离心机用离心管 可调式移液器

材料

缓冲液和溶液

贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1。
将贮存液稀释到合适的浓度。

10x 扩增缓冲液

含有四种 dNTP 的混合溶液，每一种 dNTF 的浓度为 2.5 mmol/L

酶和缓冲液

热稳定 DNA 聚合酶 [Hot-Tub DNA 聚合酶（Amersham) 或同类产品]
大多数 DNA 聚合酶保存在含 50% 甘油的贮存液中。这种溶液非常粘稠，很难准确取量。最简单的方法是在微型离心机上将含酶的离心管在 4°C 以最大转速离心 10s, 然后用一个可调式移液器取出所需数量的酶。用一个带屏障装置的自动移液器装配 PCR 反应成分。

凝胶

1% 的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶（含 0.5ug/ml 溴化乙锭）。

核酸和核苷酸

引物
将正向和反向内引物以 100umol/L(100pmole/ul) 的浓度溶解在水中。
将诱变引物以 10mmol/L(10pmole/ul) 浓度溶解在水中。

模板 DNA

通过溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心（第 1 章方案 10 或 11) 或用 Qiagen 树脂柱层析纯化超螺旋双链质粒 DNA(第 1 章方案 9)。将模板 DNA 以 0.1ug/ml 的浓度溶解在 TE(pH8.0) 溶液中。

专用设备

带屏障装置的自动移液器用吸头

微型离心机用离心管（扩增用 0.5 ml 薄壁管）

可调式移液器

可按所需扩增条件设定程序的热循环仪
如果热循环仪不配备加热盖装置，使用矿物油或石蜡油以防止 PCR 过程中反应混合物液体挥发。

其他试剂

本方案步骤 6 所需的试剂列在第 1 章方案 17 或 19 中。

方法

1. 使用 0.5 ml 微量离心管或扩增反应管（置冰上），混合下列第一轮扩增反应需要的

试剂：

10X 扩增缓冲液 10ul
质粒 DNA 模板 200~400pg
2.5 mmol/LdNTP 溶液 8ul
诱变引物 10pmoles
低 Tm 值侧引物 lOOpmoles
热稳定 DNA 聚合酶 0.5ul(2.5 单位）
加水至 100ul

如果厂商提供的热稳定 DNA 聚合酶 10x 扩增缓冲液中不含 MgCl2, 加入所需体积的 0.1mol/L MgCl₂，使反应混合物中含有 DNA 聚合酶反应最适浓度的二价离子。

2. 如果热循环仪没有加热盖，加入一滴石蜡油（约 50ul) 覆盖 PCR 反应。将反应管放置在热循环仪中。

3. 用下表中给出的变性、退火、聚合反应所需的时间和溫度扩增核酸


上述反应条件适合于 0.5 ml 薄壁管和 100ul 反应体积，在 Perkin-Elmer 9600 9700, Master Cycler(Eppendorf) 或 PTC.100 (MJ Research) 热循环仪上进行：使用其他类型的仪器或不同的反应体积时需调整上述反应条件。每1000bp 长的靶 DNA 聚合反应应进行 1 min。

4. 第一次 PCR 反应完成后再把下列成分加入到同一反应管中：

髙了 Tm 值的侧引物 100pmoles
热稳定 DNA 聚合酶 0.5ul(2.5 个单位）
2.5 mmol/LdNTP 溶液 3ul
用移液器温和的上下吸打几次混匀上述反应物。可离心几秒钟，将所有的试剂收集到离心管底部。
可以取 3~5ul 第一次 PCR 反应混合物，经琼脂糖凝胶电泳快速分析证实是否成功的合成了大引物 PCR 产物。

5. 接下来进行第二轮扩增反应，反应由 25 个循环和二步温度组成：

94°C,40S
72°C,90s 最后的延伸步骤为 72°C,5 min。

6. 取第二轮 PCR 扩增反应的 5% 进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，估计扩增出的靶 DNA 浓度。
如果引物内设置了限制酶位点，用相应的限制酶消化扩增 DNA, 然后次级克隆进适合的载体。也可以将步骤 5 磷酸化的扩增 DNA 连接至限制酶消化后产生纯端的质粒载体中。这种方法的诱变率大约为 80%, 通常仅需要挑选 6 个克隆进行 DNA 序列分析确认存在所希望的突变体，并肯定在 DNA 全序列中不存在其他的突变。