3.材料和方法
塑料CrystalCard由烯烃共聚物制成。每一个CrystalCard有两个分开的微细管大约有10µL体积。每一个微细管都可以完成一个优化实验。CrystalCard中液滴的形成要求低表面能的表面。这样可以确保传递液(FC-40)优先浸湿微细管壁。为准备液滴形成的微细管表面，Cytonix PFC 502AFA溶液用于涂抹微细管内部。使用涂层，CrystalCard通过Cytonix 502AFA入口充满，而且能在室温下储存0.5到1小时。通过真空从CrystalCard去除502AFA溶液，紧接着在333–343 K固化1小时。
CrystalCard有四个液体进去口，依次为传递液（1），蛋白质（2），沉淀剂（3）和缓冲液（4）。缓冲液，蛋白和沉淀剂进入通道合并为3 + 1 mixer，这里水溶液相结合，并分割成单个液滴的惰性和不混溶流体载体。注射器和聚四氟乙烯管被传递液回填，需要的水溶液都从聚四氟乙烯套管末端吸入。通过聚四氟乙烯管和一个聚丙烯连接器完成CrystalCard连接，形成一个密封的CrystalCard口。实验的组成液体安置在带有注射器泵的聚四氟乙烯管，通过以前使用的MicroPlugger泵控制软件在一定程度上传递到CrystalCard(Gerdts et al., 2008)。CrystalCard上的液体配置显示在图2。
水溶液的流动速率可以改变，这样可以有一系列梯度的液滴的生成。本研究中，我们首次使用两种类型的梯度（表1和图3）。1型梯度中，蛋白质以恒定的速率(2µL min-1)传送尽管沉淀剂和缓冲液形成线性梯度（总的沉淀剂和缓冲液流量保持恒定2µL min-1）。对于大多数1型梯度，沉淀剂的流量开始时设定为2µL min-1，随后流量慢慢的减小，缓冲液以相同的数率缓慢的增加。因此在所有的1型实验中，蛋白浓度保持恒定只改变沉淀剂的浓度（表1）。在梯度2型中，在蛋白和沉淀剂之间产生动态梯度。在梯度2型中，蛋白流量缓慢减少，沉淀剂流量缓慢增加，缓冲液流量保持恒定（表1）。总的来说，1型梯度首先产生蛋白/沉淀剂组合，如果没有结晶体筛选，2型梯度通常紧接着产生。
表1：本研究中使用的1型和2型MPCS梯度流量表（µL min-1)
图3：通过MPCS优化产生的结晶体获得的高质量的数据集(2.5 A °或更好)和/或新的蛋白结构。液滴下市对应的蛋白结构图（数据采集和统计数据见表2）。所有的比例尺=200µm。（a）从Mycobacterium tuberculosis得到的Enoyl-CoA水合酶（1.8 A ° ; PDB code 3h81);（b）Bartonella henselae中的得到的醛脱氢酶（2.1 A ° ; PDB code 3i44;通过坐滴法优化产生的2.0 A °的编码3i44的结构已存入PDB数据库，2.1 A °分辨率的数据集是由MPCS结晶优化产生的）；（c）从Burkholderia pseudomallei得到的蛋氨酸-R-亚砜还原酶（1.7 A ° ; PDB code 3cxk）；（d）Brucella melitensis中得到的甲基异柠檬酸裂解酶（2.9 A ° ; PDB code 3eoo);（e）Babesia bovis中得到的二氢叶酸还原酶/胸苷酸合成酶(2.5 A ° ; PDB code 3i3r);（f）Bartonella henselae中得到的tRNA 鸟嘌呤-n1-转甲基酶（2.5 A ° ; PDB code 3ief);（g）商品化的MPCS Plug Maker图片。左：用户界面和CrystalCard成像的触摸屏。右：仪器样品台用于载入CrystalCard和结晶样品。
本研究中使用的沉淀剂可以从Emerald Biosystems(Wizard I, Wizard II, Wizard III, JCSG+ and Precipitant Synergy)或Hampton Research(Crystal Screen HT and Index HT)得到。用户指定的Wizard I和Wizard II也可以使用。Wizard I和Wizard II主要沉淀剂浓度增加50-100%。
CrystalCard中直接提取的结晶体可以直接用于下游的X射线衍射分析（图2d）。100µm厚的粘合层剥离后为了暴露理想的结晶体用于收获。通常吸取大约1微升的事先准备的冷冻保护剂在理想的结晶体上。之后结晶体使用传统的尼龙冷环玻璃化法从微细管中拿出，（约2毫米直径，Hampton Research)，储存于液氮中用于X射线分析。在个别情况下，结晶体被发现在100µm的连接层。在这种情况下，结晶体被冷冻保护剂覆盖并且从塑料层顶部收获。
4.结果
MPCS梯度在优化气象扩散结晶采样数时有很高的成功率。通过MPCS优化的29种蛋白中，有28种（93%）使用MPCS优化后结晶。本研究中使用的许多蛋白在最初的筛选中使用多于一种沉淀剂溶液。总之，120种不同的蛋白/沉淀剂结晶组合在气象扩散法中产生。在这120种组合中，MPCS优化实验中产生的90（75%）的结晶—结晶的成功率很高，许多最初的结晶体不是单晶，但是微晶或沉淀物看起来像是结晶体（图1）。此外，MPCS实验体积明显减小（50-100倍）同时从气象扩散法得到的结晶体转变为batch-under-oil-style结晶。再次，在气象扩散法中不能产生结晶的10种沉淀剂溶液被用于MPCS优化实验中能够产生结晶体。这些特殊的沉淀剂用MPCS进行了测试（尽管用气象扩散法不能产生结晶体），因为他们和其他的能够在气象扩散实验中产生结晶体的沉淀剂溶液具有相似的化学成分。总的来说，使用这种方法测试了17种沉淀剂溶液，有十种可以产生结晶体（59%）。这表明，利用MPCS在标准结晶体筛选中优化每一种沉淀剂可能会产生许多特殊的结晶体采集数，这些采集数可能会在单一的气象扩散试验中失败—与batch-under-oil-style结晶的气象扩散相比于先前报道的数据一致(Baldock et al., 1996;D’Arcy et al., 2003)。超过90%的沉淀剂溶液用气象扩散试验检测的用MPCS不用检测，这表明，利用MPCS有潜在的发现新的结晶体采集数的能力。本研究中使用了各种各样的沉淀剂溶液，包括各种盐溶液，低pH（4.5）到高pH（10.5）溶液，高粘度聚乙二醇溶液和有机物如异丙醇和2-甲基-2,4-戊二醇。