利用纳米孔测序技术揭示基因表达的染色质调控基础

　　作为染色质的基本单元，核小体由大约147 bp的DNA和组蛋白八聚体（H2A, H2B, H3和H4）组成。核小体的动态定位和折叠组织会产生两种不同的染色质状态：“开放”（open）和“闭合”（closed）。核小体的定位和染色质状态的动态变化对以DNA为模板的生物学过程（比如，转录、DNA复制和修复）具有关键的调控作用。

　　基于第二代“短读长”测序技术（比如，Illumina测序）的方法（比如，MNase-seq、DNase-seq、ATAC-seq、NOMe-seq、MPE-seq、ChIP-seq和FAIRE-seq）已经被广泛地应用于核小体位置和染色质状态的测定。然而，这些方法只能测定“细胞群体水平、短距离”的核小体占据和染色质状态。尽管最近单细胞测序技术已经被整合到这些方法中，并且揭示了细胞群体中染色质状态的异质性，但由于单细胞测序的低基因组覆盖度以及第二代测序长度的限制，目前我们仍旧对细胞群体中染色质状态异质性以及长距离的染色质动态变化的缺乏了解。值得注意的是，美国太平洋生物科学公司（Pacific Biosciences，PacBio）开发的“单分子、实时”测序（single-moleculereal-time）技术以及英国牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）技术开发的纳米孔“单分子、实时”测序技术，不仅极大地增加了测序的长度（达到数百万个碱基对），而且提供了测序DNA模板的“单DNA分子”信息。

　　2019年6月14日，美国俄亥俄州立大学（OhioState University）的区健辉（Kin Fai Au）研究组在Genome Research上在线发表研究论文Single-molecule long-read sequencing reveals thechromatin basis of gene expression，结合外源甲基转移酶处理和牛津纳米孔测序技术，开发了一种用于测定“单分子、长距离”水平的核小体定位和染色质状态的方法，MeSMLR-seq（methyltransferase treatmentfollowed by single-molecule long-read sequencing）。

　　该实验方法主要包括两部分：第一，利用GpC特异的甲基转移酶（M.CviPI）将位于裸露DNA上的胞嘧啶（cytosine）转换成5-甲基胞嘧啶（5mC）；第二，利用牛津纳米孔测序技术（Oxford Nanopore Technologies）进行5mC的直接检测，随后基于5mC的分布进行核小体定位和染色质状态分析。同时，作者也开发了相应的生物信息学工具NP-SMLR （https://github.com/Au-Lab/NP-SMLR），用于5mC的检测，以及核小体的定位分析。

　　研究人员将MeSMLR-seq应用于单倍体的酵母细胞（一个基因组拷贝），实现“单个DNA分子”（single DNA molecule）对“单个细胞”（single cell）的模拟。借助于模拟数据，作者首先证实了MeSMLR-seq在单分子水平5mC检测和核小体定位分析方面的准确性和稳健性。接着，研究者展示了MeSMLR-seq在群体细胞水平核小体定位和染色质状态分析方面，与已有方法（包括MNase-seq、ATAC-seq和DNase-seq）具有高度的一致性。

　　借助于MeSMLR-seq的“单分子、长距离”优势，研究者揭示了转录起始位点周围的核小体组织规则：对于沉默转录的基因，在一个细胞群体中核小体定位（nucleosome positioning）具有更大的异质性（heterogeneity）；而对于激活转录的基因，核小体的间距分布（nucleosome spacing）具有更高的均一性（uniformity）。

　　进一步，结合单细胞转录组数据（single-cell RNA-seq），作者定量地揭示了染色质开放状态和基因转录活性的正相关关系。

　　通过量化基因启动子区的开放程度，研究者分析了转录重编程过程中，染色质状态的协同变化。最后，作者调查了两个在基因组位置临近的葡萄糖转运基因（HXT6和HXT3）在应答葡萄糖浓度变化时，呈现出的转录活性以及“偶联”的染色质状态的变化。

　　总之，该研究开发了一种用于“单分子、长距离”水平染色质状态分析的新方法，为研究基因表达的染色质调控提供了基础。除了单倍体的酵母细胞，MeSMLR-seq方法也可以用于多倍体高等生物（比如，人和小鼠）细胞中DNA甲基化以及染色质状态的研究。最近的一些研究表明，牛津纳米孔测序可以直接鉴定内源的CpG特异的DNA 5mC。MeSMLR-seq的单个DNA分子可以同时测量DNA甲基化（内源CpG特异的5mC），以及核小体定位和染色质状态（基于外源GpC特异的5mC）。

　　该研究（MeSMLR-seq）是区健辉课题组将第三代测序技术应用于表观遗传学研究的第一个工作，区健辉课题组的王运浩博士和王安琪博士为共同第一作者。

　　此外，区健辉课题组长期致力于第三代测序技术领域的研究，已经开发了一批专门用于第三代转录组测序数据分析的生物信息学工具，包括IDP（转录组构建）、IDP-fusion（融合基因鉴定）、IDP-ASE（等位基因特异性表达分析）、IDP-denovo（转录组组装）、IDP-APA（选择性多聚腺苷酸化分析）以及其他一些用于各种复杂转录事件分析的工具（https://github.com/yunhaowang）。

　　论文链接：

　　https://genome.cshlp.org/content/early/2019/06/14/gr.251116.119.abstract