利用间接放射免疫法检测样品的mTNF

实验概要

本实验利用间接放射免疫法检测样品的mTNF。选用两种抗体，一抗为抗TNF抗体，可与细胞膜表面的mTNF特异性结合；二抗为抗一抗抗体，且标记放射性同位数¹²⁵I，可与一抗特异性结合，通过测定其放射活性，并与标准品对照，即可间接测定细胞膜表面的TNF。

实验原理

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一类能直接导致某些肿瘤细胞坏死的细胞因子，有TNF-α与TNF-β两种类型。TNF-α主要来源于活化的单核/巨噬细胞，TNF-β主要来源于活化的T淋巴细胞。虽然两型TNF的细胞来源不同，结构也不同，但均能与不同的受体结合，故具有极其相似的生物学活性。TNF可进入体液成为分泌型(或可溶性)TNF(sTNF)，也可与细胞膜结合成为跨膜型(或膜结合型)TNF(mTNF)。应用标记的抗TNF特异性抗体，利用抗原抗体反应检测TNF即为TNF的免疫学检测法。可检测待测样品中sTNF的精确定量，也可检测mTNF，还可区分TNF-α与TNF-β两种类型。主要方法有ELISA法、RIA法、FIA、FCM或FACS法等。

主要试剂

1. 1%多聚甲醛

2. 含3%牛血清白蛋白的PBS(3%BSA-PBS)及PBS

3. 一抗：兔抗TNF的抗血清

4. 二抗：¹²⁵I标记的驴抗兔IgG

5. 未免疫兔血清

6. 制备好的巨噬细胞悬液(细胞浓度为1×10⁶ml)

主要设备

1. 96孔PVC板(聚本乙稀板)

2. γ-计数仪，温浴箱，刻度吸管，毛细吸管，加样器(头)

实验步骤

1. 将准备好的巨噬细胞悬液加入PVC板各孔中，0.1ml/孔，再用1%多聚甲醛固定于PVC板中，然后用PBS洗去多余的多聚甲醛；

2. 设立不同倍比稀释度的TNF标准品；

3. 加入3%BSA-PBS，每孔0.1ml， 37℃孵育1h，以封闭抗体非特异性结合位点；

4. 弃上清，每孔加入1：50稀释度的兔抗TNF血清(一抗)。以未免疫兔血清作为阴性对照，37℃孵育45min；

5. 用PBS洗3次，以去除未结合的一抗；

6. 加入¹²⁵I标记的驴抗兔IgG(二抗，2000cpm/孔)，37℃孵育45min；

7. 用PBS充分洗板后，用γ-计数仪测量放射活性；

8. 从标准曲线中即可求得待测细胞mTNF含量。