利用Ambion的MicroPoly(A)Pure试剂盒分离mRNA实验

原始细胞

乙醇

组织均化器 MicroPoly(A)Pure 试剂盒

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

乙醇,100%

2. 特殊设备

组织均化器（可选），见二、方法步骤 4

水浴，预设到 70°C

3. 其他

MicroPoly(A)Pure 试剂盒（Ambion)

4. 细胞和组织

原始细胞

二、方法

1. 将洗脱缓冲液预热到 70°C。

2.250 g 离心沉降细胞后移弃上清液。

3. 在 PBS 中溫和重悬后离心，对细胞沉降物进行第一次洗涤。弃上清液。

4. 加 250ul 裂解液。用组织均化器或通过剧烈振荡或抽吸进行均质化。估计裂解产的体积，以作为「起始体积」。

5. 加 2 倍起始体积的稀释缓冲液。倒置或摇动 10s 进行混合。

6.4°C 下 12000 g 离心 15 min。将上清液转至一新管中。

7. 向样品中加一小瓶 oligo(dT) 纤维素。倒置混合。室温下轻柔搅动温育 30~60 min。

8. 室温下 4000 g 离心 3 min。

9. 转移上清液，保存上清液直到实验证明有 mRNA 被纯化出来。

10. 向寡脱氧胸苷酸纤维素沉降物中加 1 ml 结合缓冲液，倒置混合，4000 g 离心 3 min,弃结合缓冲液，重复该步骒两次。

11. 向沉降物中加 lml 洗涤缓冲液，倒置混合，4000 g 离心 3 min 移弃洗涤缓冲液并重复该步骤两次。

12. 将一离心柱放入洗涤管中，在 400ul 洗涤缓冲液中重悬 oligo(dT) 纤维素。将溶液转移到离心套柱中并于 4000 g 短暂离心，弃流过物。

13. 向离心套柱加 500ul 洗涤缓冲液。用一移液管头混合树脂，小心避免破坏柱中的膜。室温下短时离心，弃流过物并重复该步骤。保存最后一次洗涤的流过物。

14. 确定流过物的 A₂₆₀。如 A₂₆₀ 小于 0.05，继续进行方案；如 A₂₆₀ 大于 0.05, 重复用500ul 洗涤缓冲液进行洗涤，直到 A₂₆₀ 小于 0.05。

15. 将离心套柱放入一新的微量离心管，向离心套柱加 100ul70°C 的洗脱缓冲液，立即于 5000 g 离心。向离心套柱另加 100ul 热的洗脱缓冲液并于 5000 g 短暂离心。弃离心套柱。

16. 将 20ul 5mol/L 的醋酸铵、1ul 糖原和 550ul 的 100% 乙酵加到洗脱的 mRNA 中，-20°C 沉淀过夜。

17.4°C 下大于或等于 12000 g 离心 20 min 回收 mRNA。

18. 小心移弃上清液，再次短暂离心，用一尖头移液管移弃所有残液。

19. 将沉降物再溶解于 1~20ul 由试剂盒提供的经 DEPC 处理的 H₂O/EDTA 中剧烈振荡彻底溶解沉降物。于-70°C 储存 RNA。