利用Ion半导体测序开展基因表达谱分析

     新一代测序技术的出现改变了基因表达谱分析和转录组研究。在其他方法还依赖预知信息进行杂交探针或qPCR引物设计时，RNA-Seq技术可直接对测序文库中任一RNA分子进行无假设的分析。RNA-Seq技术不单能测定转录本数，研究表达水平差异 [1]，还能检测序列特异的信息，如转录本的起始和终止位点[2]、SNV [3]，和RNA编辑事件[4]。RNA-Seq技术还具有一些其他优势，包括更高的灵敏度、更广的动态范围，以及评估融合转录本和变异表达水平的能力。

         Ion PGM™测序仪推动了RNA-Seq技术的普及。结合Ion Total RNA-Seq Kit v2[5]和Ambion ERCC Spike-In Control提供的额外质量控制[6]，Ion半导体测序生成数据的灵敏度超过了传统微阵列芯片。Ion半导体测序能够在单次实验中对新转录本、基因融合和等位基因特异表达同时进行检测。Ion PGM™测序仪配有多种产量不同的芯片组合，适合多种转录组大小并能扩展到不同的RNA测序应用。Ion半导体测序提供zui快的测序流程，100 base读取的测序运行时间只需约2小时，数据分析直观简便数据分析直观简便（可使用公共软件）。

         那么，究竟Ion PGM™测序仪生成多少个100 base读取能相当于一个基因表达微阵列芯片呢？在白皮书[9]中我们对Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays （HG-U133 Plus 2.0）的芯片质量控制（MAQC）的微阵列数据与Ion PGM™系统生成的RNA-Seq数据进行了比较。图1显示了Ion PGM™测序仪数据按照不同检测阈值下所得的基因数和微阵列芯片所能检测到的基因数。当采用zui严谨的检测阈值即每个基因≥10读取时，两百万个来自Ion PGM™测序仪的已定位读取所能检测到的基因数超过了微阵列芯片能检测的基因。当读取计数阈值放宽到≥5读段数/基因时，仅仅1百万个Ion RNA-Seq已定位读取所能检测到的基因数就超过了芯片的基因检测数。利用来自Ion PGM™测序仪的2百万个平均读取所能检测到的显著差异表达基因数（sig DEGs）要多于微阵列芯片所能检测到的sig DEGs数。在p ≤0.05和倍数变化f≥2标准下，在HBRR和UHRR样本中Ion PGM™测序仪得到的sig DEGs数为4,630，而相比之下芯片得到的sig DEGs数为4,198。

        可扩展的技术：RNA-Seq的一个独特优势在于，通过生成的读取数目，可以轻而易举地调节实验灵敏度。Ion PGM™测序仪的配套芯片组合和新RNA barcodes（Ion Xpress™ RNA-Seq Barcode01-16试剂盒）让研究者能根据实验需要选择读取数目。具有6百万微孔的Ion 316™ 芯片适用于小型转录组研究。而超过一千一百万微孔的Ion 318™芯片能生成超过两百万定位RefSeq exons的读取[10]，如上所述其灵敏度超越了HG-U133 Plus 2.0 array。随着Ion半导体测序技术的持续快速发展，转录组分析能力和方法也将随之改进。例如，经过优化的Dynabeads mRNA DIRECT™ Micro试剂盒在从总RNA抽提mRNA时，能进一步减少产物中的rRNA含量，增加定位于RefSeq的读取数。如图6所示，使用这个仅耗时30分钟的从总RNA中纯化poly（A） RNA的方法，定位于rRNA的读取数显著降低，而相应增加了定位于RefSeq exons的读取数。