制备克隆实验

ATP -巯基乙醇 IPTG X-gal 平末端限制酶 连接缓冲液 T4DNA 连接酶 平末端插入物 克隆载体 培养基

FALCON 2059 多聚丙烯试管 37°C 恒温箱 水浴箱

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

ATP(10 mmol/L)

β-巯基乙醇（可选择）

IPTG(100 mmol/L，溶于水中）

X-gal(100 mg/ml，溶于二甲基甲酰胺)

2. 酶和酶缓冲液

平末端限制酶（5U), 比如，SrfⅠ限制性内切酶（Stratagene)

连接缓冲液，l0X(250 mmol/LTris-HCl、pH7.5，100 mmol/L 氯化镁，100mmol/LDTT,200ug/ml BSA)

T4DNA 连接酶（4U)

3. 核酸和寡核苷酸

平末端插入物（100ng/ul)

克隆载体（10ng/ul)

4. 培养基

(1)SOC 培养基（每升用量：20 g tryptone，5 g 酵母提取物，0.5 gNaCl，加水到 900 ml。高压灭菌。另外，单独混合好下面物质：2.03 g 氯化镁，1.2 g 硫酸镁,3.6 g 葡萄糖，加水到终体积为 100 ml，过滤灭菌。然后加入已凉下来的高压灭菌过的培基）。

(2)LB(Luria Broth) 球脂平板 [每升用量：lOg NaCl，lOg Bacto-tryptone，5 gBacto-酵母提取物，20 g Bacto 琼脂。用 5mol/LNaOH 调整 pH 到 7.0。加入去离子水到终体积为 1L。高压灭菌，然后倒入培养皿中（大约 25 ml/100 mm 平板）]。

(3) 青霉素-新青霉素 LB 平板（20ug/ml 青霉素，80ug/ml 新青霉素）。用来降低卫星菌落的形成。高压灭菌的培养基冷却到 55°C, 再加入过滤灭菌的抗生素。

(4) 氯霉素 LB 平板（30ug/ml)。
高压灭菌的培养基冷却到 55°C, 再加入过滤灭菌的抗生素。

(5) 可以选做 X-gal/IPTG 平板：若要表型选择转化子，向含有适当抗生素的琼脂平板中加入 20ul X-gal 和 20ul IPTG 溶液，立即摇匀，使它们分布均匀（可能会出现轻微的沉淀）。
不要混合 X-gal 和 IPTG, 因为这些化合物会沉淀。
重要：在涂板前让平板干燥 15~30 min。

5. 专用设备

FALCON 2059 多聚丙烯试管

37°C 恒温箱

水浴，预设到 37°C、42°C、65°C

6. 细胞和组织

适当的大肠埃希菌菌株，比如，XLl-Blue(Stratagene)，按照 Sambrook 和 Russe Ⅱ(2001) 所述方法做成感受态，或者去买做好的。

二、方法

1. 连接

（1）在一个高压灭菌的 1.5 ml 试管中建立 PCR-Script 反应体系，按顺序加入如下试剂。

克隆载体（10ng/ul)                                 1ul

连接反应缓冲液，10X                              1ul

ATP(10 mmol/L)                                        0.5ul

Pfu 拋光 PCR 产物插入物*                       1~4ul

Srf I 限制性内切酶（5U)                           1ul

T4DNA 连接酶（4U)                                 1ul

H₂O                                                          补充到 10ul

*对于连接反应，理想的插入物：载体 DNA 值是可变的。对于样品 DNA, 从 5:1(当用抛光插入物时）到 100：1(当用非拋光插入物时）可能是必需的。用非拋光插入物时需要更大的插入物：载体值，这是因为 PCR 片段两端都是平末端的机遇很低。对一个特定的插入片段，最好用下面的方程来优化条件：

                                                             pmol 末端/ugDNA=2X10⁶/碱基对数目

（2）轻轻混匀，在室温温浴 1~2 h。

（3）65°C 热处理样品 10min。

（4）把样品在冰上保存，准备转化感受态大肠杆菌。

2. 转化

（1）在冰上融化感受态细胞。

（2）轻轻搅动混匀细胞，移取 40ul 细胞到一个 15 ml 预冷的 FALCON 2059 试管。

（3）可选做：向 40ul 细菌中加入，疏基乙醇（至终浓度为 25 mmol/L)。

（4）轻轻搅动，置于冰上 10min, 每隔 2 min 轻轻搅动一下。

（5）加入 2ul 已经热处理过的连接反应产物 DNA(第 4 步，克隆程序）。

（6）置于冰上 30 min。

（7）在 42C 水浴中热击 30s。要获得最高的效率，热击时间长短非常关键。

（8）把转化混合物置于冰上 2 min。

（9）加入 450ul 预热（42°C) 的 SOC 培养基，37°C225~250r/min 振荡培养 1h。

（10）取出 50~200ul(100ul 是标准用量）转化好的混合物，用一个无菌的到叉将它们均匀涂布于恰当的抗生素平板上。

可以选做：向 LB 平板中加入一种可以生成色素的底物来检测重组体；同时参见β-半乳糖苷酶颜色选择，如下。
如果涂 100ul 振荡培养物，可以直接把细胞涂布在平板上; 如果涂少于 100ul 转化混合物，用 SOC 培养基将转化混合物的最终体积增加到 200ul, 再进行涂板。

（11）将平板在 37°C 培养过夜（大约 16 h)。

（12）选择白斑进行检测，不要选那些有轻微蓝色或者中心是蓝色的克隆。
           含有插入的菌落最初是白色，在平皿中 2~5 天后可能会出现轻微的蓝色。