制备真菌毒素液体标准物质：标签背后的故事

　　引言：许多认证实验室都使用参考物质来彰显其检测结果的溯源性和可靠性。但是对参考物质的制备知之甚少。

　　参考物质或校准物描述了物质一种或多种经过表征的特征量，用于检验或作为检测方法的参照基准。食品和饲料工业非常重视消费者的安全，进行了大量的真菌毒素检测工作，并使用参考物质确保结果可靠。

　　经常存在的危险

　　真菌毒素是自然产生的真菌次级代谢产物，对人和动物都有毒。真菌在田间和储存期间都会滋生。真菌毒素在全球大多数农产品中都有发现，已知真菌毒素种类已经超过380种。所以各国针对多种植物源食品（谷物、小麦、玉米等）都设定了不同真菌毒素的最高允许残留量。强制要求相关食品生产商认真检测样品，以确保其生产产品的品质。

　　下表对液体参考物质的制备过程进行了简单的概括：

　　制备

　　通常，真菌在理想环境中生长时才会产生真菌毒素（高温高湿环境、充足的营养）。

　　在实验室中，整个故事从调整人工生长环境开始，这也是获得更高真菌毒素产量的先决条件。

　　菌种经过一段时间的保藏后难免会发生变异，产生新的代谢产物。

　　这些产物会极大地影响分离步骤。

　　因此，为了减少突变、杂质等不期望的性状产生，必须定期更新菌种。

图1 筛选菌株

　　第一步，发酵，重点是将实验室环境尽可能地调整成适合真菌增殖的环境。

　　针对不同菌种的培养基差异也很大，需要提供不同配比的盐类和矿物质等营养物质。

　　真菌经过一段时间的生长后（几天或者几周），体系里就会含有真菌代谢培养基后产生的真菌毒素。

图2 发酵过程

　　严格受控的发酵过程完成后，选用合适的有机溶剂将培养产物中的真菌毒素提取出来。

　　取决于产物分子结构，有的选用极性溶剂，有的选择非极性的。

　　在发酵过程中，除了目标真菌毒素外，真菌还会产生杂质（如其他代谢物、色素、酯类物质等）。

　　这导致了粗提物中通常含有大量杂质。

　　在分离和提纯过程中，经过色谱学分离或其他不同分离性能的制备步骤，目标真菌毒素被一步步纯化，最终要达到纯度大于98%的目标。

　　举个例子，某些毒素分子的结构非常理想，可以通过重结晶的方式进行提纯（例如冷却溶液、溶剂蒸发或加入沉淀剂等方式）；

　　另外的毒素可能不能结晶，只能通过冷冻干燥的方式获得粉末。

　　如此反复进行重结晶的步骤，逐步提高纯度，直到达到目标要求。

图3 制备色谱分离纯化

　　获得目标纯度的固体真菌毒素后，可以进行下一步承重、溶解和混匀的步骤。

　　称重时要选用经过计量认证的天平，并在固体物质恢复至室温后才能进行操作，防止吸潮现象发生。

　　然后选用经过计量认证的容量瓶进行定容和混匀。

　　质量控制

　　通常采用高效液相色谱、紫外分光光度计和液质联用对产物的纯度进行确认。

　　根据毒素种类的不同，可以选择高效液相色谱-二极管阵列检测器、荧光检测器或其他检测器，也可以选用紫外分光光度计或者液质联用进行表征。

　　特别要说明的是，针对13C同位素标记的真菌毒素，必须使用质谱对其同位素的纯度进行确认（例如>98% 13C原子）。

图4 使用LC-MS/MS检测

　　真菌毒素参考物质是市场中的小众产品，有时很难找到商业化的，可用于生产和品控过程控制的参考物质。

　　分装

　　通过最后的品控后，固态的真菌毒素就变成真菌毒素参考物质溶液了。

　　对该批次产品进行分装，并为每一支标准品准备符合ISO Guide 31要求的证书，声明其表征浓度和不确定度（至于不确定度怎么用，那就是以后要讲的故事了）。

　　一支高品质的真菌毒素液体标准品就这样诞生了！

　　（本文作者是Anna LILEK，Romer Labs^®品控经理，由懒猫君编译整理。）