| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | MgCl2核苷三磷酸溶液转录缓冲液去离子超滤水T7 RNA 聚合酶固体 EDTA尿素缓冲液NaCl乙醇EDTAATPT4 多核苷酸激酶缓冲液T4 多核苷酸激酶T4 DNA 连接酶缓冲液T4 DNA 连接酶乙酸钾溶液兔网织红细胞裂解物翻译试剂盒氯化钾乙酸镁不含核酸酶的水兔网织红细胞裂解物35S甲硫氨酸对照 RNA |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1. 如下在冰上配制 1 ml 转录反应混合物，最后加入 T7 RNA 聚合酶： DNA库（终浓度为 5～50 nmol/L） 35 ul 1 mol/L MgCl2 50 ul 各成分为 100 mmol/L 核苷三磷酸混合物（各 NTP 终浓度为 5 mmol/L） 100 ul 10× 转录缓冲液（最终为 1×） 加入去离子超滤水补至 980 ul 20 ul 10 U/ul T7 RNA 聚合酶（最终为 200 U/ml） 转录反应于 37℃ 孵育 3～16 h。用冰上冷却或加入固体EDTA至终浓度 50 mmol/L 以终止反应。 2. 用变性 PAGE 纯化所得的 RNA。往转录反应中加入固体尿素至 5 mol/ L、加入 EDTA 至 50 mmol/L， 于 90°C 加热 2 min， 上样到变性 PAGE 胶上。 3. 电泳结束后，紫外照射显影并割下纯化的 RNA 条带。通过被动洗脱将 RNA 提取到 300 mmol/L NaCl 溶液中或用电洗脱仪并按厂家的说明将RNA洗脱到 0.5×TBE 中。 4. 加入3 mol/L NaCl （终浓度 300 mmol/L）和 2.5 倍体积的乙醇沉淀 RNA。 于 -80℃ 冷冻 20 min 或于 -20℃ 冷冻过夜。 5. 于 4℃，12 000 g 离心 10 min 弃上清，用 70％ 乙醇洗涤沉淀，抽干，溶于 0.5 ml 去离子超滤水中，用紫外-可见分光光度计测量 260 nm 的吸收值以测定浓度。 6. 合成接头，即 3' 端为嘌呤霉素的 DNA 寡核苷酸，长度约为 30 核苷酸，「无结构」 例 a.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCP 例 b.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA999ACCP 在例 b 中，「9」 是指 phosphoramidite spacer 9 （Glen Research），「P」指嘌呤霉素， 来源于CPG-嘌呤霉素（Glen Research）。该接头能得到高显示的蛋白质产量。 以嘌呤霉素为末端的DNA寡核苷酸是用变性 PAGE 胶纯化，从胶里回收，然后如前所述沉淀下来。将 DNA 接头溶解于去离子水中并用紫外-可见分光光度计测量 260 nm 的吸收值以测定浓度。 7. 用多核苷酸激酶憐酸化 DNA 接头的 5' 端，1 ml激酶反应体系如下： 300 ul 100 um DNA 接头（终浓度 30 um） 10 ul 100 mmol/L ATP （终浓度 1 mmol/L） 100 ul 10×T4 多核苷酸激酶缓冲液（终浓度 1×） 490 ul 水 100 ul 10 U/ul T4 多核苷酸激酶（最终为 200 U/ml） 8. 反应混合物在 37°C 孵育 2 h，加入200 ul 100 mmol/L EDTA，90℃ 加热 5 min，然后用凝胶过滤柱脱盐。 9.合成 splint。splint是一种 DNA 寡核苷酸，其序列为（从 5' 端起）与 RNA 库的 3' 端互补的≥10 核苷酸加上与接头 5' 端互补的≥10 核苷酸， 通常为 T10。用变性 PAGE 纯化。 10. 如步骤 3 从凝胶提取、如步骤 4 沉淀 DNA。 11. 用去离子水溶解纯化的 splint 并用紫外-可见分光光度计测量 260 nm 的吸收值以测定浓度（见步骤 5）。 12. 在 splint 存在下用 T4 DNA 连接酶连接接头和 RNA 模板以产生 mRNA 显示模板。 配制下列 1 ml 连接反应体系： 100 ul 100 umol/L 5' 磷酸化的 DNA 接头（最终为10 um） 100 ul 100 umol/L RNA 库（最终为 10 um） 100 ul 100 umol/L splint （最终为 10 um） 580 ul 水 13. 混合物加热到 95℃ 放置 2 min，然后加入 100 10×T4 DNA连接酶缓冲液（最终为 1×） 14. 将所得混合物涡旋振荡，置于冰上冷却 10 min， 然后使其升至室温后加入 20 ul 2000 U/ul T4 DNA 连接酶（最终为 40 U/ml）。 15.反应体系在室温下孵育 20 min。加入 150 ul 100 mmol/L EDTA 和 500 mg 固体尿素，90℃ 加热 5 min。 16. 用变性 PAGE 胶纯化连接好的 mRNA 显示模板，胶回收（见步骤 3）， 然后如步骤 4 沉淀，但是改用 3 mol/L 乙酸钾（pH 5.3）代替 3 mol/L 氯化钠。 17. 用去离子水溶解纯化的 mRNA 显示模板并用紫外-可见分光光度计测量 260 nm 的吸收值以测定浓度。 在 mRNA 显示模板用于大规模翻译之前，应当尝试一并进行各种对照组的小规模翻译以有助于在蛋白胶上鉴别 mRNA 展示蛋白所对应的条带。 18. 在冰上配制翻译反应体系，最后加入兔网织红细胞裂解物。 19. 于 30℃ 孵育 1 h，然后往各反应体系中加入 1.7 ul 1 mol/L MgCl2 和 7.8 ul 2.5 mol/ L KCl， 于室温下放置 5 min。 20. 用 Tris-tricine SDS-PAGE 分析各个翻译反应的产物。 21. 一旦显示的蛋白质已用 SDS-PAGE 观察到，优化反应体系的乙酸镁和氯化钾的浓度。逐渐从 0.5～2 mmol/L 增加乙酸镁的浓度以及氯化钾的浓度从 50～200 mmol/L 平行进行一系列的翻译反应。 22. 如下在冰上制备 1 ml 反应体系，最后加入网织红细胞裂解物： 80 ul 5 umol/L mRNA 显模板（最终为 400 nmol/L） 80 ul 12.5×不含甲硫氨酸的翻译混合物（最终为 1×） 20 ul 8.6 umol/L ［35S］ 甲硫氨酸（最终为 0.17 umol/L） 2.5 mol/L KCl （按照优化浓度） 0.5 ul 乙酸镁（按照优化浓度） 补水至 600 ul 400 ul 2.5×兔网织红细胞裂解物（最终为1X） 总体积 1000 ul 23. 于 30℃ 孵育 1 h， 然后往上述各反应体系中加入 65 ul 1 mol/L MgCl2 和 235 ul 2.5 mol/L KCl，于室温下放置 5 min。 |
| 注意事项 | |
| 其他 | 1. 材料 DNA库 2. 试剂 1 mol/L MgCl2 100 mmol/L 核苷三磷酸溶液 10× 转录缓冲液 去离子超滤水 10 U/ul T7 RNA 聚合酶 固体 EDTA 尿素 0.5×TBE 缓冲液 3 mol/L NaCl 100％ 和70％ 乙醇 100 mmol/L EDTA 末端为嘌呤霉素的DNA 接头 100 mmol/L ATP T4 多核苷酸激酶缓冲液 T4 多核苷酸激酶 10×T4 DNA 连接酶缓冲液 10 U/ul T4 DNA 连接酶 3 mol/L 乙酸钾溶液，pH 5.3 兔网织红细胞裂解物翻译试剂盒（如 Red Nova Lysate kit， Novagen） 对照 RNA 12.5× 不含甲硫氨酸的翻译混合物 2.5 mol/L 氯化钾 25 mmol/L 乙酸镁 不含核酸酶的水 兔网织红细胞裂解物 35S 甲硫氨酸 3. 耗材 电洗脱仪（VWR 或 Schle1cher SchuelD） 变性 PAGE 胶凝胶过滤柱（Pharmacia） |
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