制备DNA测序模板实验

大肠杆菌

LB TE M13聚乙二醇容易让 顶层琼脂 乙酸钠 乙醇

巴斯德吸管 试管 离心机

1.  如果起始用M13复制型DNA或M13单链DNA，以0.5 ng 重组M13mp复制型DNA或5~10 ng 单链DNA转化40 μl  感受态大肠杆菌DH5αF'株，按热休克方案进行转化。

2.  转化细胞加0.2 ml大肠杆菌DH5αF'过夜培养物后，混匀于3 ml H顶层琼脂，倾倒于37℃平板，倒扣后置于37℃过夜。

3.  大肠杆菌DH5αF'过夜培养物以2×TY培养液稀释100倍，分装于18 mm×150 mm 试管，每份1.5 ml。

4.  用无菌巴斯吸管挑取M13mp 噬斑，并置于上述每份培养物中，要注意确保琼脂块已玻转移。

5.  重复进行挑斑，在37℃生长细菌5~6  h。

6.  细菌培养物移至1.5 ml 微量离心管中，于4℃或室温高速离心5 min，上清移至一个干净的1.5 ml 微量离心管中。

7.  噬菌体上清加入200 μl M13 PEG溶液，混匀，于室温放置15 min，高速离心5 min，弃上清。

8.  高速离心30 s，并以头部已拉细的巴斯德吸管吸出残余液体。

9.  以100 μl TE重悬沉淀，加入100 μl 缓冲液平衡酚，旋涡混合器轻轻振荡15~20 s。

10.  于4℃或室温高速离心5 min，转移上上清水相于一个干净的微量离心管中。

11.  加入11 μl 3 mol/l pH5.2的乙酸钠和250 μl 100%乙醇，于-70℃冷冻20 min。

12.  4℃高速离心10 min，弃上清。

13.  加入100 μl 冰冷70%乙醇，微量离心，弃上清，重复此70%乙醇冼涤1次。

14.  在Speedvac真空旋转蒸犮器中干燥沉淀。

15.  沉淀重溶于20 μl 缓冲液，取0.5 μl 在小型凝胶中电泳，以确证DNA的浓度。

16.  剩余贮于-20℃直到用作模板进行测序反应。