动物免疫实验

实验概要

将某种蛋白注射新西兰大耳兔产生免疫反应，通过ELISA检测免疫产生的抗体。

实验原理

将抗原吸附在固相载体表面，加入抗血清，抗体和抗原在载体表面形成抗原-抗体复合物，洗去未结合抗体，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（抗体的抗体），二抗与抗体结合，洗去未结合二抗，加底物显色剂显色，在一定波长下测定  OD 值，根据 OD 值判断血清中抗体的产生情况。

主要试剂

PBS 缓冲液

弗氏完全佐剂

弗氏不完全佐剂

碳酸盐缓冲液

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 二抗稀释液

TMB 底物溶液 A 液与 B 液

主要设备

研钵

注射器

兔固定架

锥形瓶

酶联板

洗板机

酶标仪

实验材料

新西兰大耳兔（公）

实验步骤

1. 抗原的乳化

    以无菌 PBS 缓冲液溶解抗原，使总蛋白的浓度为 2 mg/mL，将弗氏完全佐剂与抗原溶液以 1∶1 比例混合，在干净无菌的研钵内研磨，直至形成稳定的油包水型乳剂（一小滴乳剂在水面上不扩散）。

2. 初次免疫

(1)    获得阴性血清

免疫前，耳缘静脉采血约 2 mL。置 37℃ 1 h，4℃静置过夜使血清析出，离心（2000 r/min，4℃，10 min），吸取上清，分装后 -80℃保存。

(2)    注射

用弗氏完全佐剂乳化的抗原溶液，在兔背部、大腿处进行皮内、肌肉多点注射。皮内注射：每处约 0.1 mL，共注射 20-30处；肌肉注射：每点 1 mL，两点注射。注射完毕，轻轻按摩注射部位以帮助吸收，注射位置出现白色小皮丘。

3. 加强免疫

一周后，用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行加强免疫，过程同初次免疫。每隔一周，以 PBS溶解的抗原（总蛋白浓度为 2 mg/mL）加强免疫一次。

免疫 4 次后，间接 ELISA 法测定抗血清效价上升情况。

4. 抗血清的制备

(1)    血清中抗体的效价上升且达到稳定值后，加强免疫一次，一星期后可采血获得大量抗血清；

(2)    采血前保证饮水，但停食一天，以降低血脂；

(3)    将大耳兔用兔固定架固定；

(4)    心脏采血，采血后的注射器需静置，以免发生溶血现象；

(5)    将采得血液 37℃静置 1 h，4℃过夜，离心（3000 r/min，4℃，10 min），吸取上清，分装为不同体积，-80℃保存备用。

5. 间接 ELISA 测定

(1)    以包被液（碳酸盐缓冲液）包被抗原溶液，使对应抗原终浓度为 0.5 µg/mL；

(2)    在酶联板的每孔中加入 100 µL 抗原包被液，处理及对照包括：

抗原包被液＋一抗＋二抗

抗原包被液＋二抗

轻轻振动平板使抗原分布均匀，将包被的微量滴定板用塑料保鲜膜封好，37℃潮湿孵育 60 min，再置 4℃过夜；加有抗原溶液的微量滴定板封好后于 4℃可保存数月。

(3)    次日，在洗板机上用 PBST 洗涤三次；

(4)    每孔加入 150 µL~200 µ L封闭液，37℃潮湿孵育 60 min；

(5)    倒掉封闭液，用 PBST 洗涤三次，最后每块滴定板用一大纸巾包裹，孔口朝下，在几张纸巾上轻轻拍打，弃去残余的液体；

(6)    用稀释液将抗血清做 1∶20、1∶40、1∶80、1∶160 稀释，取 100 µL 分别加入到对应包被孔中，微量滴定板用塑料保鲜膜封好，37℃潮湿孵育 60 min；

(7)    洗板机上用 PBST 洗涤三次，最后一次洗涤后，如步骤 5 所述弃去残余液体；

(8)    每孔中加入 100 µL 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 二抗稀释液（1∶10000 稀释），37℃潮湿孵育 60 min，洗涤三次；

(9)    混合 TMB 底物溶液 A 液与 B 液，每孔加入 50 µL，37℃显色 15~30 min；

(10)  每孔中加入 50 µL 2 mol/L H₂SO₄ 终止反应；

(11)  酶标仪上测定 OD₄₅₀ 值。